趙浩晨 王婉婷 雷佳美 徐艷

摘要：以銀杏果肉質(zhì)外種皮為原料，采用水提醇沉法提取其水溶性多糖。以過氧化氫為脫色劑，多糖脫色率和保留率為指標(biāo)，脫色時間、脫色溫度、pH值和過氧化氫體積分?jǐn)?shù)為試驗因素，進(jìn)行單因素試驗，以確定影響脫色的因素及其水平，采用L9（34）正交設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化試驗。采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、還原力測定法對多糖進(jìn)行抗氧化活性檢測。結(jié)果表明，脫色溫度為 60 ℃，脫色時間為1 h，pH值為8，過氧化氫加入量為8%時脫色效果最佳?？寡趸瘻y定結(jié)果表明，銀杏外種皮多糖具有良好的抗氧化活性，脫色后抗氧化活性略有降低。

關(guān)鍵詞：銀杏果;外種皮;過氧化氫;脫色;多糖;抗氧化活性

中圖分類號： R284.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0228-04

收稿日期：2019-04-09

基金項目：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項目（編號：201810157338）。

作者簡介：趙浩晨（1996—），男，遼寧撫順人，主要從事生物工程研究。E-mail：99644880@qq.com。

通信作者：徐 艷，博士，講師，主要從事天然產(chǎn)物活性研究。E-mail：1472105886@qq.com。

銀杏（Ginkgo biloba L.）果，俗稱白果，其營養(yǎng)非常豐富，在許多國家和地區(qū)均有大量分布，自古以來被當(dāng)作營養(yǎng)豐富的高級滋補(bǔ)品[1]。目前，對銀杏葉和果的研究已取得了很多進(jìn)展[2-4]，但對銀杏果果外種皮的研究還較少。銀杏果外種皮是銀杏種子硬殼外面的肉質(zhì)部分，長期以來被作為廢物丟棄，既浪費了資源，又污染了環(huán)境[5]。據(jù)統(tǒng)計，我國每年約有3萬t外種皮作為廢物被丟棄。近幾年的研究表明，銀杏外種皮具有多方面藥理活性，有較高的利用價值[6]。銀杏外種皮含有多種化合物，包括多糖、酚酸、黃酮、銀杏內(nèi)酯等[7-9]。其中，多糖含量最高，且具有抗氧化、抑菌、增強(qiáng)免疫力等多種生物活性[10-11]。

然而，銀杏外種皮經(jīng)過水提醇沉后得到的多糖呈現(xiàn)深褐色，色素屬于雜質(zhì)性物質(zhì)，會阻礙多糖的進(jìn)一步分離純化，并阻礙作用機(jī)制等方面的研究。因此，有必要對多糖進(jìn)行脫色。過氧化氫脫色法是利用過氧化氫在水溶液中可電離出過氧化氫根離子（HO-2）與發(fā)色基團(tuán)作用，使得發(fā)色基團(tuán)被破壞而起到脫色作用，該方法具有脫色后不易復(fù)色的特點，主要適用于色素多且含有不飽和雙鍵、羥基和芳香環(huán)的物質(zhì)[12-13]。但H2O2也可能造成多糖的氧化或破壞，因此結(jié)合多糖保留率指標(biāo)來篩選出H2O2的更優(yōu)水平。

本研究采用過氧化氫進(jìn)行氧化脫色，以多糖脫色率和保留率為評價指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交試驗優(yōu)化脫色工藝，并研究脫色前后多糖的抗氧化活性。

1 材料、試劑與儀器

材料：銀杏果，2018年10月采自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，去核，于-70 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，A Johnson Matthey Company）;體積分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫以及葡萄糖、濃硫酸、蒽酮等試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：UV-2100型分光光度計[龍尼可（上海）儀器有限公司];HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）;

2 試驗方法

2.1 銀杏果外種皮多糖的提取

稱取銀杏果外種皮200 g，將其用勻漿機(jī)打成漿，采用乙醇回流法去除其中的脂溶性物質(zhì)，將剩余濾渣用水煎煮法提取水溶性多糖，提取2次，每次2 h，合并濾液。采用Sevage法對粗多糖水溶液進(jìn)行脫蛋白處理。用三氯甲烷 ∶ 正丁醇為4 ∶ 1的混合液反復(fù)萃取多糖水溶液，直至中間白色蛋白層消失為止。將脫蛋白后的多糖水溶液用3倍量乙醇進(jìn)行沉淀，靜止過夜，用乙醇抽洗至干。

2.2 過氧化氫對銀杏外種皮多糖進(jìn)行脫色的工藝研究[14]

選擇過氧化氫為脫色劑，以脫色時間、脫色溫度、pH值和過氧化氫體積分?jǐn)?shù)為試驗因素，進(jìn)行單因素試驗，以確定脫色影響因素及其水平，采用 L9（34） 正交設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化試驗，以多糖脫色率、保留率為考察最佳脫色工藝的指標(biāo)。多糖含量的測定采用硫酸-蒽酮法。

多糖脫色率=（D1-D2）/D1×100%;

（1）

多糖保留率=M后/M前×100%。

（2）

式中：D1、D2分別為多糖溶液在脫色前、后的吸光度;M前、M后分別為多糖溶液在脫色前、后的多糖含量。

2.2.1 脫色的影響因素及其水平的確定[15] 準(zhǔn)確移取多糖溶液，考察過氧化氫加入量（4%、6%、8%、10%、12%）、脫色時間（0.5、1、2、3 h）、pH值（8、9、10、11）、脫色溫度（40、50、60、70 ℃）4個因素對多糖脫色率的影響。

2.2.2 正交試驗設(shè)計

2.2.2.1 正交試驗因素與水平設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗，正交試驗因素與水平設(shè)計詳見表1。

2.2.2.2 正交試驗 采用L9（34）正交設(shè)計進(jìn)行試驗。

2.3 銀杏外種皮多糖的抗氧化活性測定

采取提取物與穩(wěn)定自由基DPPH反應(yīng)的分析方法考察多糖對DPPH自由基的清除率[16]，采用鐵離子還原法（FRAP）和鐵氰化鉀還原法來測定多糖的還原性[17]。

3 結(jié)果與分析

3.1 脫色的影響因素及其水平的確定

3.1.1 過氧化氫加入量對脫色的影響 由圖1可知，隨著H2O2加入量的增加，多糖脫色率提高。H2O2加入量由4%增加到6%時，脫色趨勢平緩，多糖脫色率增加3.0百分點。H2O2加入量由6%增加到10%時，多糖脫色率增加7.5百分點，超過10%，多糖脫色率變化不大。因此，考慮脫色效果及成本，選擇6%、8%、10% 3個水平的H2O2加入量進(jìn)行正交試驗。

3.1.2 脫色時間對過氧化氫脫色的影響 由圖2可知，在脫色時間0.5～2.0 h內(nèi)，脫色率隨脫色時間的增加而上升，然后脫色趨勢平緩，因此，考慮選擇1、2、3 h共3個水平的脫色時間進(jìn)行正交試驗。

3.1.3 pH值對過氧化氫脫色的影響 由圖3可知，當(dāng)pH值由8增加到9時，脫色率快速升高。但當(dāng)pH值超過10后，脫色率增幅不大。因此，選用pH值8、9、10共3個水平進(jìn)行正交試驗。

3.1.4 脫色溫度對過氧化氫脫色的影響 由圖4可知，當(dāng)脫色溫度由40 ℃升到50 ℃時，脫色率略有提高。但當(dāng)脫色溫度超過50 ℃時，脫色率反而下降。因此，選用40、50、60 ℃ 3個水平的脫色溫度進(jìn)行正交試驗。

3.2 正交試驗結(jié)果

由表2可知，各因素對脫色率的影響程度依次為C>D>B>A，各因素對多糖保留率的影響程度依次為D>C>A>B。各因素對脫色率與保留率乘積的影響程度依次為C>D>B>A。k值顯示，各因素最優(yōu)水平為A3B1C1D2，即脫色溫度為60 ℃，脫色時間為1 h，pH值為8，過氧化氫加入量為8%。

3.3 脫色對銀杏外種皮多糖抗氧化活性的影響

3.3.1 對DPPH自由基清除活性的影響 由圖5可知，隨多糖濃度的增加，銀杏外種皮多糖對DPPH自由基清除活性增強(qiáng)。脫色后多糖清除DPPH自由基活性略有下降，但變化不大。

3.3.2 對多糖還原力的影響 由圖6可知，隨多糖質(zhì)量濃度的增加，銀杏外種皮多糖還原力增強(qiáng)。脫色后多糖還原力略有下降，但變化不大。

4 結(jié)論與討論

以過氧化氫為脫色劑，采用單因素試驗和正交試驗對脫色條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為脫色溫度60 ℃，脫色時間1 h，pH值8，過氧化氫加入量8%。用過氧化氫對銀杏外種皮多糖脫色，工藝簡單，多糖保留率高。多糖脫色后抗氧化活性略有下降，但變化不明顯。

目前常用的多糖脫色方法有活性碳脫色法、過氧化氫氧化脫色法。但活性炭吸附色素的同時，多糖損失也較多，而且后期過濾較為困難。過氧化氫脫色現(xiàn)象明顯，多糖保留率高，雖然過氧化氫脫色會使多糖部分氧化，活性略有降低，但仍不失為一種簡單、可行的脫色方法。

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