王六合，王 濤，劉文偉，張 震

（1.烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊 830091）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是正黏病毒科的RNA 病毒，根據(jù)病毒粒子表面抗原血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的不同，分為不同亞型，目前發(fā)現(xiàn)有18種HA 亞型和11種NA亞型[1]，其中H1—H16、N1—N9 各亞型流感病毒均可在禽類中分離到[2]。禽流感對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害極大，因而被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，其中高致病性禽流感被我國(guó)列為一類動(dòng)物疫病[3]。AIV 不僅血清型較多，而且毒株容易變異[4]，其中高致病性AIV 還具有蔓延速度快、致死率高等特點(diǎn)。AIV 也會(huì)感染人。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)人感染病例都有活禽接觸史或去過活禽交易市場(chǎng)，而且活禽市場(chǎng)環(huán)境中有較高的病毒陽(yáng)性率。目前認(rèn)為活禽交易、屠宰、加工等涉禽場(chǎng)所是人感染的主要地點(diǎn)。對(duì)這些地點(diǎn)進(jìn)行合理消毒是切斷禽流感傳播途徑的一種有效方法。因此，為了解新疆烏魯木齊市活禽交易市場(chǎng)AIV 污染狀況，開展了活禽檔口、活禽屠宰點(diǎn)以及活禽運(yùn)輸車輛三大主要環(huán)節(jié)的AIV核酸檢測(cè)，以期為降低活禽交易市場(chǎng)禽源流感向外界傳播的風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)活禽市場(chǎng)清洗消毒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 柱式RNA 核酸提取試劑盒（批號(hào)YRNA-TQ 20190926P）、AIV 通用型熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)AIV20191018P），哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司提供；H5、H7 和H9亞型AIV 三重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)60050），深圳澳東檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司提供。

1.1.2 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)3K15），購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)QuantStudio 5），購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；瞬時(shí)離心機(jī)（型號(hào)MinX-5），購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。

1.1.3 樣本 每個(gè)活禽檔口，采集地面、墻面（高于地面約0.8 m）、籠具、采食槽、污水及糞便的棉拭子；每輛活禽運(yùn)輸車，采集輪胎、車廂、籠具及駕駛室棉拭子；每個(gè)活禽屠宰點(diǎn)，采集脫毛機(jī)、接血槽、刀具案板、污水及地面棉拭子。將采集后的樣本放在裝有冰袋的采樣箱內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。共在該活禽交易市場(chǎng)的49個(gè)活禽檔口、16 輛活禽運(yùn)輸車和23個(gè)活禽屠宰點(diǎn)，采集473 份棉拭子樣本。

1.2 方法

1.2.1 樣品滅活 將采集的棉拭子樣品放入恒溫水浴鍋中，56 ℃ 30 min 滅活。

1.2.2 AIV 核酸提取 將水浴鍋中的棉拭子樣品取出后，置于振蕩器充分震蕩，然后8 000 r/min，離心2 min；取100 mL 上清液至1.5 mL 滅菌離心管中，參照柱式RNA 核酸提取試劑盒說明書提取AIV RNA，并將提取后的核酸-20 ℃保存待檢測(cè)。

1.2.3 AIV 核酸檢測(cè) 將提取的RNA 核酸，參照AIV 通用型熒光定量RT-PCR 檢測(cè)劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 AIV 核酸分型 將檢測(cè)為陽(yáng)性的核酸，參照H5、H7 和H9 亞型三重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行分型，對(duì)陰性樣品定義為未分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 AIV 核酸檢測(cè)

2.1.1 基本情況 473 份棉拭子樣本中，檢出AIV 核酸陽(yáng)性115 份，陽(yáng)性檢出率為24.31%。其中：活禽屠宰點(diǎn)陽(yáng)性25 份，陽(yáng)性檢出率為21.74%；活禽檔口71 份，陽(yáng)性檢出率為24.15%；活禽運(yùn)輸車19 份，陽(yáng)性檢出率為29.69%。

2.1.2 活禽檔口 在6種棉拭子樣品中，均有陽(yáng)性樣品被檢出，其中污水和籠具樣品的陽(yáng)性檢出率較高，分別為44.90%和34.69%，墻面和地面較低，分別為12.24%和10.20%（表1），說明活禽檔口AIV 污染較廣，而污水和籠具是活禽檔口最嚴(yán)重的AIV 污染源。RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果見圖1。

表1 活禽檔口棉拭子AIV 核酸檢測(cè)結(jié)果

圖1 活禽檔口棉拭子AIV 核酸熒光RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.1.3 活禽運(yùn)輸車 在4種棉拭子樣品中均檢出AIV 陽(yáng)性，其中運(yùn)輸車輛車廂內(nèi)裝活禽的籠具污染最嚴(yán)重，陽(yáng)性檢出率為56.25%，輪胎中的陽(yáng)性檢出率最低，為12.50%（表2），說明活禽運(yùn)輸車輛的AIV 污染較嚴(yán)重，其中籠具是運(yùn)輸車輛污染的最重要環(huán)節(jié)。RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果見圖2。

表2 活禽運(yùn)輸車棉拭子AIV 核酸檢測(cè)結(jié)果

2.1.4 活禽屠宰點(diǎn) 在5種棉拭子樣品中，除地面未檢出陽(yáng)性外，其余4種均檢出陽(yáng)性，其中脫毛機(jī)和接血槽陽(yáng)性檢出率較高，分別為47.8%和34.78%（表3），說明活禽屠宰點(diǎn)的屠宰工具或用具最易污染AIV。RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果見圖3。

圖2 活禽運(yùn)輸車棉拭子AIV 核酸熒光RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

表3 活禽屠宰點(diǎn)棉拭子AIV 核酸檢測(cè)結(jié)果

圖3 活禽屠宰點(diǎn)棉拭子AIV 核酸熒光RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 AIV 核酸分型

115 份AIV 核酸陽(yáng)性樣品，經(jīng)H5、H7 和H9亞型三重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測(cè)，檢出H5 亞型26份，陽(yáng)性檢出率為22.6%，H9 亞型45 份，陽(yáng)性檢出率為39.13%，未定型44 份，陽(yáng)性檢出率為38.26%，未檢出H7 亞型（表4），說明活禽市場(chǎng)H9 亞型AIV 污染最嚴(yán)重，也存在一定比例的H5亞型病毒污染。H5 和H7 亞型AIV 核酸熒光RTPCR 檢測(cè)結(jié)果分別見圖4 和圖5。

表4 不同類型樣本的AIV 核酸分型情況比較

圖4 H5 亞型AIV 核酸熒光RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

3 討論

2014年7 月新疆報(bào)告首例人H7N9 流感病例，加之烏魯木齊作為新疆地區(qū)的首府城市，是最大的活禽集散、交易、流通地，又有3 條候鳥遷徙路徑途徑烏魯木齊市，因此高致病性禽流感給本地區(qū)人民的生命財(cái)產(chǎn)安全造成極大威脅。為了便于集中統(tǒng)一監(jiān)督管理，烏魯木齊市將原3個(gè)活禽交易市場(chǎng)搬遷集中至該活禽市場(chǎng)。從該活禽交易市場(chǎng)3個(gè)主要環(huán)節(jié)來看，活禽運(yùn)輸車（29.7%）、活禽檔口（24.15%）、活禽屠宰點(diǎn)（21.74%）都存在AIV 污染，而且污染都較為嚴(yán)重。從我國(guó)其他省市活禽交易市場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果來看，廣東省廣州市活禽交易市場(chǎng)AIV 核酸群陽(yáng)性率為49.21%，廣東省東莞市陽(yáng)性率為11.05%，安徽省惠州市陽(yáng)性率為22.14%，2014—2017年云南省保山市陽(yáng)性率為2.50%～68.18%。這些均充分說明活禽交易市場(chǎng)散播AIV 的風(fēng)險(xiǎn)較高。

活禽檔口內(nèi)的污水、籠具、糞便陽(yáng)性檢出率較高，與閉福銀等[6]、薛娜等[7]的相關(guān)報(bào)道一致，說明這些是活禽市場(chǎng)禽流感防控消毒工作的關(guān)鍵點(diǎn)?；钋輽n口內(nèi)的污水污染狀況很大程度上跟內(nèi)部的排水系統(tǒng)有關(guān)。據(jù)調(diào)查，該市場(chǎng)內(nèi)22個(gè)檔口的下水道均有不同程度的堵塞，且沖洗籠具、地面等污水未經(jīng)嚴(yán)格消毒直接排出。因此，應(yīng)盡快改善交易市場(chǎng)活禽檔口內(nèi)的排水系統(tǒng)，盡可能保障污水能及時(shí)排出。由于從事活禽交易職業(yè)人群的自我防范意識(shí)差[8]，且活禽交易市場(chǎng)人員密集、流動(dòng)性強(qiáng)，已成為人感染AIV 的最危險(xiǎn)場(chǎng)所，因此應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)活禽交易職業(yè)人群的禽流感知識(shí)培訓(xùn)，提高其自我防護(hù)意識(shí)。

活禽運(yùn)輸車裝載活禽的籠具陽(yáng)性檢出率高達(dá)56.25%，是活禽運(yùn)輸環(huán)節(jié)的關(guān)鍵消毒點(diǎn)。冬季室外溫度較低，活禽排泄物容易結(jié)冰，更易導(dǎo)致沖洗消毒不徹底，這可能是籠具陽(yáng)性檢出率較高的主要原因。有4 輛車的駕駛室檢出陽(yáng)性，說明駕駛員的流動(dòng)也會(huì)造成病毒傳播。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該活禽交易市場(chǎng)內(nèi)的活禽大多不是本地飼養(yǎng)而是由外地運(yùn)輸而來的，提示應(yīng)該做好運(yùn)輸檢疫，對(duì)進(jìn)入活禽交易市場(chǎng)內(nèi)的活禽運(yùn)輸車輛嚴(yán)格把關(guān)，要經(jīng)產(chǎn)地檢疫認(rèn)可、抽樣檢疫認(rèn)可、工具消毒認(rèn)可后，才能三點(diǎn)連一線，開檢疫證明，驗(yàn)證放行[9]。要做好入場(chǎng)消毒，這是避免疫病憑借交通運(yùn)輸工具傳播蔓延的有效方法。

活禽屠宰點(diǎn)的脫毛機(jī)、接血槽陽(yáng)性檢出率較高，是市場(chǎng)活禽屠宰點(diǎn)禽流感防控消毒工作的關(guān)鍵點(diǎn)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，屠宰點(diǎn)對(duì)屠宰工具的消毒并不全面徹底，只把消毒重心放到了地面消毒上。雖然一般情況下AIV 跨種傳播能力較低[10]，但仍存在感染人的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是有交易市場(chǎng)活禽接觸史和暴露史的人群[11-12]。目前認(rèn)為，活禽屠宰加工點(diǎn)、交易市場(chǎng)等涉禽場(chǎng)所是人感染AIV 的高風(fēng)險(xiǎn)地點(diǎn)[13-14]。

各亞型陽(yáng)性率比較發(fā)現(xiàn)，H9 亞型陽(yáng)性檢出率較高（39.13%）。這可能與市場(chǎng)內(nèi)水禽數(shù)量較多而且種類復(fù)雜有關(guān)。調(diào)查顯示，該市場(chǎng)每日鴨子、鵝及鵪鶉的交易數(shù)量占交易活禽總數(shù)的10%。建議該活禽交易市場(chǎng)盡量將交易水禽集中至固定檔口，與陸禽分開。該市場(chǎng)也存在一定比例的H5 亞型病毒污染（22.6%），提示活禽養(yǎng)殖戶應(yīng)在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)進(jìn)一步加強(qiáng)H5 亞型的防控工作。

此次調(diào)查是在冬季開展的，因此只掌握了冬季該活禽交易市場(chǎng)AIV 污染狀況和分布特點(diǎn)，計(jì)劃后期在春、夏及秋季持續(xù)開展調(diào)查，以充分了解活禽交易市場(chǎng)全年的AIV 污染分布狀況，從而科學(xué)有效指導(dǎo)交易市場(chǎng)開展消毒工作。

4 結(jié)論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該活禽交易市場(chǎng)AIV 污染較為嚴(yán)重，活禽運(yùn)輸車、活禽檔口和活禽屠宰點(diǎn)均有污染，其中活禽檔口中的污水、籠具、糞便，活禽屠宰點(diǎn)的脫毛機(jī)、接血槽，以及活禽運(yùn)輸車的裝載籠具為AIV 傳播的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，應(yīng)特別注意加強(qiáng)消毒。