張 慧，張安潔，劉 爽，董雅琴，李曉成，魏 榮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201）

豬肺炎支原體可引起豬地方流行性肺炎，俗稱氣喘病。該病廣泛分布于世界各地，以咳嗽和氣喘為主要臨診癥狀，不同年齡豬群均易感，表現(xiàn)為長期生長發(fā)育不良、飼料轉(zhuǎn)化率低、發(fā)病率高，但死亡率較低。豬肺炎支原體還常與多種細菌、病毒及環(huán)境因子協(xié)同作用，引起豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC），導(dǎo)致嚴重的臨床疾病，造成較大的經(jīng)濟損失，對養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重危害[1-2]。

豬肺炎支原體分離培養(yǎng)過程繁瑣、耗時長，雖然是診斷該病的金標準，但并非常規(guī)診斷方法。目前，對提取的樣品核酸直接進行基因分型已成為該病流行病學(xué)調(diào)查中的常用方法[3]。關(guān)于豬肺炎支原體的分型方法有多種，包括借助毒力基因作為分型依據(jù)的方法，如編碼黏附素樣蛋白的p146基因分型。該基因包含絲氨酸重復(fù)序列，可用于數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（variable-number tandem repeat，VNTR）分析[4-5]或序列分析[6]。多位點數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiple-locus variable-number tandem repeat，MLVA）[7]是借助管家基因作為分型依據(jù)的方法，如多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）[8]。MLST 重復(fù)性好，操作簡便，易于實驗室間比較，已被廣泛應(yīng)用于微生物流行病學(xué)檢測和進化研究。在豬肺炎支原體流行病學(xué)調(diào)查中，常常將MLST 與VNTR 或p146基因分型相結(jié)合[9-10]。本研究對采集自山東、廣西、江蘇、河南、江西等地區(qū)的豬組織樣品進行豬肺炎支原體檢測以及MLST 及p146基因分析，并與數(shù)據(jù)庫中的豬肺炎支原體分離株進行比對，以期為豬肺炎支原體流行和預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

高通量核酸提取儀：德國QIAGEN；高速臺式離心機：日本TAKARA；熒光定量PCR 儀：Bio Rad CFX96；移液器：Eppendorf。

Premix ExTaqTM（Probe qPCR），PremixTaqTM（ExTaqTMVersion 2.0）：寶生物工程（大連）有限公司；核酸提取試劑盒：德國QIAGEN；Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip：BIO-RAD；異丙醇、無水乙醇等：國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 豬肺炎支原體檢測 2018—2019年采集山東、廣西、河南、江西、云南、天津、湖南等地豬組織樣品（淋巴結(jié)及肺組織）共計1 242 份，先用mhp165/183 熒光定量方法[11]篩選豬肺炎支原體陽性樣品，再用巢式PCR 方法[12]檢測并測序確認，最終對檢出的87 份（7.0%）陽性樣品進行MLST分型。

1.2.2 MLST 及p146基因分型選擇adk、rpoB、tpiA3個管家基因作為分型參考，對檢出的87 份陽性樣品進行PCR 擴增，記錄3個管家基因均擴增成功的樣品，并將3個管家基因均擴增成功的樣品進行p146基因擴增，引物序列見表1。將擴增產(chǎn)物測序，并在數(shù)據(jù)庫（http://pubmlst.org）中找出并沿用與測序基因組相同的等位基因號，在數(shù)據(jù)庫中輸入3個管家基因及p146基因的等位基因號，得到對應(yīng)的序列類型（ST）。

表1 管家基因及p146 基因引物序列

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用PHYLOViZ 軟件BURST算法進行分組和聚類，對數(shù)據(jù)庫中來自15個國家的151個ST，劃分為相應(yīng)的克隆譜系來研究其進化關(guān)系；采用MEGA v6.0 軟件Clustal W 算法，進行管家基因及p146基因序列比對；分別用最大似然（maximum likehood）及鄰接（neighbor-joining）算法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)抽樣1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 MLST 及p146 基因分型

在87 份豬支原體肺炎陽性樣品中，有24 份樣品3個管家基因全部擴增且測序成功，擴增成功率（27.6%）高于同時擴增7個管家基因，與Kuhnert等[13]的研究結(jié)果一致。等位基因（adk、rpoB、tpiA、p146）及相應(yīng)的ST 見表2。24 份樣品檢測分為10個ST，均為新發(fā)現(xiàn)的ST。其中，ST128在本次檢測中占41.7%（10/24），樣品來自江蘇、河南和廣西。分別計算兩種分型方法的辛普森指數(shù)，得出p146為0.947（95%CI：0.898～0.995），MLST 為0.823（95%CI：0.695～0.951）。

根據(jù)maximum likehood，對管家基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖1）顯示：大多數(shù)樣品（23/24）屬于A 和B 兩系，大多數(shù)ST（8/10）位于A 系，包括美國232 株、英國J 株和中國168 株，ST129為B 系，ST130、法國BQ14 株和巴西7448 株處于A 和B 系之外。對ST 相同的菌株進行p146基因neighbor-joining 分析，可將ST128、ST129 進一步分為兩個分支。

2.2 eBURST 分析

本研究將至少包含2個ST 定義為1個CC，其中每個ST 至少與組中任意1個ST 共享3個等位基因中的2個。151個ST 共分為13個CC 和49個獨特型（singleton），其中CC0 包含43個ST，占ST 總數(shù)的28.5%。本次檢測新發(fā)現(xiàn)的10個ST共分為3個CC 和4個獨特型（圖2），其中CC4包含ST128、ST146、ST148、ST43（古巴分離株），樣品來自江蘇、河南和廣西，占所有分型樣品的54.2%；CC5 包含ST145、ST147 和ST61（168 株），樣品來自江西和廣西；ST130 屬于CC0，樣品來自山東。

3 討論

豬肺炎支原體是一類無細胞壁的微生物，對營養(yǎng)要求非常高。我國1973年首次分離到該病原。目前國內(nèi)外已建立了多種豬肺炎支原體PCR 檢測方法，均可針對樣品核酸直接檢測。本研究選擇敏感性較高的熒光定量PCR 方法進行初篩，用巢式PCR 并測序的方法，對初篩陽性樣品進行確認，在山東、廣西、河南、江西、江蘇、上海、云南、湖南采集的豬組織樣品中均檢測到陽性樣品，樣品陽性率為7.0%，提示豬肺炎支原體在我國廣泛存在。

表2 豬肺炎支原體MLST 分型

圖1 多位點序列進化樹

圖2 ST eBURST 分析結(jié)果

鑒于豬肺炎支原體分離培養(yǎng)時間長、分離率低[14]，近年來國外常用對提取的樣品核酸直接進行基因分型的方法，進行豬肺炎支原體流行病學(xué)調(diào)查。由于MLST 擴增基因較多（通常為efp、metG、pgiB、recA、adk、rpoB、tpiA7個管家基因），受樣品新鮮度、樣品中病原含量等因素影響，國外常用其中3個管家基因（adk、rpoB、tpiA）進行擴增，以提高擴增成功率，且3個管家基因的分型能力與7個管家基因一致[8-9，15-17]。Pubmlst 數(shù)據(jù)庫也使用3個管家基因作為ST 定型依據(jù)。本研究以國外研究為基礎(chǔ)，對我國豬肺炎支原體陽性樣本進行MLST 分析，發(fā)現(xiàn)3個管家基因擴增成功率為27.6%，檢出10個ST，均為國內(nèi)外首次報道，這為我國豬肺炎支原體的流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫研究提供了新資料。

本研究在擴增MLST 管家基因的同時，也擴增了p146基因，分別計算辛普森指數(shù)，得出p146（0.947，95%CI：0.898～0.995）大于MLST（0.823，95%CI：0.695～0.951），說明管家基因相對保守；以毒力基因p146作為分型依據(jù)，可以對ST 相同的菌株進一步進行親緣分析，從而提供更多的進化信息。在本研究中，不同的ST 型（樣品GX8-2、GXF19）卻有著相同的p146基因型（130），提示p146基因可能隨機發(fā)生了相同的突變事件，僅用p146基因分型可能不足以闡釋豬肺炎支原體之間的進化關(guān)系，因此p146基因分型可作為MLST 的補充用于流行病學(xué)調(diào)查，這與Felde 等[10]的研究一致。

分析顯示，ST128 占41.7%（10/24），樣品來自江蘇、河南和廣西，是本次檢測發(fā)現(xiàn)的主要流行型。本研究嘗試用3個管家基因，對pubmlst 數(shù)據(jù)庫中151個ST 進行eBURST 分析，發(fā)現(xiàn)ST128與ST146、ST148 均屬于CC4，是本次檢測的主要克隆復(fù)合體。古巴分離株ST43 屬于CC4，ST130屬于CC0，可能是由位于中心位置的ST48（希臘分離株）進化而來的。該分析與Mayor 等[8]對7個管家基因的聚類分析結(jié)果相比有部分差異：Mayor 等對30個ST（ST1～30）進行最小生成樹分析，聚類為4個CC，包括17個ST。這說明擴增管家基因數(shù)量的不同可能會導(dǎo)致聚類的差異。本研究有助于掌握國內(nèi)豬肺炎支原體基因型分布情況，進一步完善豬肺炎支原體流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫。

4 結(jié)論

研究表明：豬肺炎支原體在我國廣泛存在；MLST 結(jié)合p146基因分型可用于豬肺炎支原體進化關(guān)系分析；本次檢測發(fā)現(xiàn)的10個ST 均為國內(nèi)外首次報道，其中ST128 為主要流行型，表明我國豬肺炎支原體基因型具有一定的獨特性。