孫亞利，周文美，黃永光*，王小平，周 敏

（貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

苦蕎麥（Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.）屬于蓼目廖科1 a生雙子葉草本植物，主要分布于中國(guó)、俄羅斯、烏克蘭及法國(guó)等地，是自然界中較少的藥食兩用作物。苦蕎黃酮作為苦蕎麥的重要活性物質(zhì)，是一種色原酮或色原烷的衍生物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)藥價(jià)值，包括對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病患者的抗高血糖和抗氧化活性[1-2]、顯著降低心血管病人血清中過(guò)氧化物酶和膽固醇水平[3]、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性恢復(fù)癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[4]、抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]、對(duì)心臟損傷和腦損傷的保護(hù)作用[6-7]、抗血小板聚集、抗黏附活性[8]、清除自由基和高抗氧化作用[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等多種保健和醫(yī)療功效。但是苦蕎黃酮顏色偏深、味道發(fā)苦，直接食用會(huì)使人產(chǎn)生不愉悅感，令消費(fèi)者難以接受，而且苦蕎黃酮在進(jìn)入人體胃部時(shí)，容易被胃酸破壞，這限制了人體腸道對(duì)苦蕎黃酮的吸收，大大降低了人體利用率。因此，選擇一種恰當(dāng)?shù)姆椒ㄑ谏w苦蕎黃酮的顏色及苦味，并切實(shí)提高人體利用率，對(duì)于苦蕎黃酮的應(yīng)用具有極其重要的價(jià)值和意義。

微膠囊化是利用一種或多種成膜性高分子原料或加聚物包裹目標(biāo)物質(zhì)的微型修飾技術(shù)，其產(chǎn)品直徑在1～5 000 μm之間[11]。已經(jīng)報(bào)道了幾種用于微膠囊化黃酮類(lèi)化合物的方法，包括噴霧干燥法、復(fù)合凝聚法和銳孔-凝固浴法等。銳孔-凝固浴微膠囊化是壁材與芯材混合液經(jīng)銳孔處理后與凝固劑之間的物理和化學(xué)作用引起的[12]。當(dāng)混合液滴與含有Ca2+等陽(yáng)離子的硬化溶液接觸時(shí)，聚合物包圍核心，通過(guò)交聯(lián)鈣離子形成三維晶格結(jié)構(gòu)[13]。微膠囊技術(shù)的應(yīng)用效果很大程度上取決于壁材的選擇，不同壁材決定著微膠囊產(chǎn)品的理化性質(zhì)。海藻酸鹽、β-環(huán)糊精、黃原膠和殼聚糖等天然多糖由于其資源豐富、價(jià)格便宜、無(wú)毒性和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，是目前微膠囊制備的常用壁材[14]。魯曉翔等[15]以β-環(huán)糊精為壁材對(duì)玉米須黃酮進(jìn)行微膠囊化，所得包埋率為85.6%，載藥量為5.7%。潘明等[16]以黃原膠和β-環(huán)糊精作為復(fù)合壁材所得鼠曲草黃酮類(lèi)物質(zhì)微膠囊包埋率為91.14%，載藥量為8.28%。但是，由于它們?cè)谖改c道中遇到高比例的酸和膽汁濃度會(huì)發(fā)生裂解，對(duì)芯材的保護(hù)無(wú)效[17]。乳清蛋白作為干酪加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和多種功能特性。將乳清蛋白的成膜性與凝膠特性相結(jié)合，可以用于一些特定物質(zhì)的包埋。β-乳球蛋白是主要的乳清蛋白成分及主要的膠凝劑。乳清蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)表明它們可能適合開(kāi)發(fā)pH值敏感的水凝膠以控制生物活性物質(zhì)的輸送[18]。Eratte等[19]報(bào)道了使用乳清蛋白-阿拉伯膠的微膠囊化富含ω-3脂肪酸的金槍魚(yú)油。Zhang Yonggang等[20]報(bào)道了使用乳清蛋白-藻酸鹽的微膠囊化香芹酚。關(guān)于熱誘導(dǎo)的聚合乳清蛋白（polymerized whey protein，PWP）作為唯一壁材對(duì)活性物質(zhì)的包埋，在現(xiàn)有文獻(xiàn)中較少報(bào)道，PWP對(duì)黃酮類(lèi)化合物微膠囊化的相關(guān)研究更是鮮見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)研究以PWP作為唯一壁材通過(guò)銳孔-凝固浴法制備苦蕎黃酮微膠囊的工藝，并對(duì)苦蕎黃酮微膠囊的表征、熱穩(wěn)定性、在胃腸道中的緩釋性等理化特性進(jìn)行分析，考察PWP作為微膠囊唯一壁材的可能性，旨在探究一種微膠囊化的新型壁材并為苦蕎黃酮微膠囊的研究和開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎麥取自貴州師范大學(xué)試驗(yàn)基地，洗凈烘干，粉碎過(guò)篩后密封保存，采用超聲輔助醇提法[21]經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)純化后，冷凍干燥獲得苦蕎黃酮干燥粉末備用。

分離乳清蛋白（whey protein isolation，WPI，純度≥90%） 山東文興生物科技有限公司；無(wú)水氯化鈣（分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（分析純） 天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司；胃蛋白酶（酶活力3 000 U/mg）、胰酶（酶活力4 000 U/mg）北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）重慶吉元化學(xué)有限公司；無(wú)水乙醇（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；溴化鉀（分析純） 天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；THZ-82A數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司；DW-86L828W超低溫保存箱 北京盛科信德科技有限公司；GL-20G-型離心機(jī) 上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司；BCD-186D11D冰箱 海信容聲（廣東）冰箱有限公司；LS 13320激光粒度分析儀 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Q2000差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國(guó)TA公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Nicolet is50原位漫反射傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；MB35型水分測(cè)定儀 奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎黃酮微膠囊的制備

1.3.1.1 PWP的制備[22]

將WPI粉末溶于蒸餾水中，混合均勻，配制成10%乳清蛋白溶液，置于4 ℃冰箱中保存12 h后，取出靜置至室溫，調(diào)節(jié)pH值至7.0，85 ℃水浴恒溫振蕩30 min，迅速取出于冰水浴中，降至室溫。再次置于4 ℃冰箱中24 h，得PWP凝膠。

1.3.1.2 微膠囊的制備

將無(wú)水CaCl2溶解于去離子水中配制CaCl2凝固浴，置于4 ℃冰箱冷藏。準(zhǔn)確稱(chēng)取苦蕎黃酮和PWP凝膠于錐形瓶中，720 r/min磁力攪拌后，將樣品混合液移至針頭為0.45 mm的2.5 mL一次性注射器中，快速均勻滴入預(yù)先配制好的CaCl2凝固浴中制珠成型，于4 ℃固化30 min。將制得的苦蕎黃酮微膠囊用蒸餾水充分洗滌3 次、過(guò)濾，經(jīng)真空冷凍干燥，得干燥的苦蕎黃酮微膠囊產(chǎn)品。

1.3.2 苦蕎黃酮微膠囊包埋率的測(cè)定

1.3.2.1 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

苦蕎黃酮的主要成分為蕓香苷，因此苦蕎黃酮的含量以蕓香苷相對(duì)含量表示。參考李欣等[21]的方法，以吸光度為橫坐標(biāo)，蕓香苷質(zhì)量濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.029 2x+0.000 01，r=0.999 56。

1.3.2.2 微膠囊包埋率的測(cè)定[23]

微膠囊表面苦蕎黃酮含量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥后的微膠囊產(chǎn)品0.2 g，以1∶30（g/mL）的比例加入無(wú)水乙醇，充分振蕩，5 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，定容至10 mL，用1.3.2.1節(jié)方法測(cè)定。按式（1）計(jì)算表面黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

式中：W1為表面黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；C1為由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得待測(cè)液表面黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為待測(cè)液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量/g。

微膠囊中苦蕎黃酮總量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥后的微膠囊產(chǎn)品0.2 g，以1∶30的比例加入70%乙醇溶液，搖勻，于40 ℃、30 min超聲處理后，5 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，定容至10 mL，用1.3.2.1節(jié)方法測(cè)定，按式（2）計(jì)算微膠囊中苦蕎黃酮總量：

式中：W2為微膠囊中苦蕎黃酮總量/%；C2為由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得待測(cè)液微膠囊中黃酮總質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為待測(cè)液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量/g。

包埋率按式（3）計(jì)算：

1.3.3 微膠囊工藝單因素試驗(yàn)

當(dāng)攪拌速率為720 r/min時(shí)，考察芯壁比、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)、攪拌時(shí)間對(duì)微膠囊包埋率的影響。芯壁比分別為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g/g）；CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%；攪拌時(shí)間分別為30、40、50、60 min和70 min。以微膠囊包埋率為考察指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。

每組單因素試驗(yàn)做3 組平行。單因素試驗(yàn)中固定因素分別為芯壁比1∶9（g/g）、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%，攪拌時(shí)間50 min。

1.3.4 微膠囊工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，確定以芯壁比（A）、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、攪拌時(shí)間（C）這3 個(gè)因素為自變量，以微膠囊包埋率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert 8.0.6程序軟件進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Independent variables and their levels used in Box-Behnken design

1.3.5 苦蕎黃酮微膠囊理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.5.1 微膠囊水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

稱(chēng)取最優(yōu)條件下制備的苦蕎黃酮微膠囊樣品4 g，于105 ℃水分測(cè)定儀中測(cè)定微膠囊產(chǎn)品的水分含量。

1.3.5.2 微膠囊載藥量的測(cè)定

微膠囊的載藥量是指單位質(zhì)量或單位體積微膠囊所負(fù)載的藥量。按式（4）計(jì)算：

1.3.5.3 微膠囊粒徑的測(cè)定

以蒸餾水作為分散劑，通過(guò)激光粒度分析儀測(cè)定苦蕎黃酮微膠囊的粒徑[24]。

1.3.5.4 微膠囊表面微觀結(jié)構(gòu)觀察

用電子顯微鏡對(duì)苦蕎黃酮微膠囊進(jìn)行表面微觀結(jié)構(gòu)觀察，用藥匙將苦蕎黃酮微膠囊產(chǎn)品輕輕置于黏有導(dǎo)電膠帶的樣品臺(tái)上，噴金，選擇合適的視野對(duì)苦蕎黃酮微膠囊進(jìn)行拍攝觀察。

1.3.5.5 微膠囊的紅外光譜測(cè)定

通過(guò)紅外光譜分析，對(duì)樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。利用KBr對(duì)樣品進(jìn)行處理，即稱(chēng)取1 mg樣品，加入100 mg烘干的KBr粉末于研缽中研磨均勻，壓片，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，次數(shù)為32 次。

1.3.5.6 微膠囊DSC測(cè)定

采用差示掃描量熱儀，設(shè)置升溫速率10 ℃/min；升溫范圍20～240 ℃；每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，并采集數(shù)據(jù)。

1.3.5.7 模擬胃、腸液消化實(shí)驗(yàn)測(cè)定微膠囊中苦蕎黃酮釋放率

參考Wang Mu等[24]的方法，配制模擬胃液及模擬腸液。體外模擬胃液的配制：精確吸取9 mL濃鹽酸于1 000 mL燒杯中，加入800 mL去離子水及10 g胃蛋白酶，充分溶解混勻，移入1 000 mL容量瓶中，定容，4 ℃保存待用。體外模擬小腸液的配制：精確稱(chēng)取6.8 g KH2PO4于500 mL去離子水中，充分溶解，0.4% NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為6.8；另取10 g胰酶溶解于水中，將兩溶液一并移入1 000 mL容量瓶，定容，4 ℃保存待用。

準(zhǔn)確稱(chēng)取新制備的苦蕎黃酮微膠囊產(chǎn)品0.5 g于裝有20 mL模擬胃液的離心管中，37 ℃、110 r/min搖床振蕩處理4 h，4 000 r/min離心20 min，小心倒出上清液，加入20 mL模擬腸液，繼續(xù)于37 ℃、110 r/min搖床振蕩處理6 h。此間，間隔吸取1 mL消化液，測(cè)定其中苦蕎黃酮的含量，同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)體積的消化液，保持離心管中溶液體積不變?？嗍w黃酮的釋放率按式（5）計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6和DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。運(yùn)用Origin 8.6軟件完成圖表的編輯與繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 芯壁比對(duì)苦蕎黃酮微膠囊包埋率的影響

圖1 芯壁比對(duì)苦蕎黃酮微膠囊包埋率的影響Fig. 1 Effect of core/wall ratio on microencapsulation efficiency of tartary buckwheat flavonoids

芯壁比對(duì)微膠囊的包埋率及制備成本的影響主要體現(xiàn)為苦蕎黃酮的負(fù)載率。壁材過(guò)少則不能對(duì)芯材進(jìn)行充分包埋，且苦蕎黃酮相對(duì)過(guò)多會(huì)造成微膠囊表面黃酮含量增加使包埋率下降，產(chǎn)品壁材較薄也會(huì)對(duì)產(chǎn)品的保存帶來(lái)不利影響。由圖1差異性分析可知，1∶7、1∶8、1∶9及1∶10處理組分別與對(duì)照組（1∶6）有極顯著差異（P＜0.01）。當(dāng)芯壁比范圍為1∶6～1∶9 時(shí)，包埋率呈逐漸增大的趨勢(shì)，當(dāng)芯壁比超過(guò)1∶9時(shí)，包埋率呈下降趨勢(shì)。這是由于壁材濃度過(guò)大不利于凝固浴中產(chǎn)品的固化，致使微膠囊化效率降低，同時(shí)造成原材料的浪費(fèi)。綜上，確定芯壁比1∶9較為適宜。

2.2 CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎黃酮微膠囊包埋率的影響

由圖2可知，CaCl2作為苦蕎黃酮微膠囊的凝固劑，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)品效果有不同程度的影響。經(jīng)差異性分析，1.4%、1.6%及1.8%處理組分別與對(duì)照組（CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%）有極顯著差異（P＜0.01），1.2%處理組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。當(dāng)CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)（＜1.4%），產(chǎn)品表面黏性較大，分散性較差，容易黏成團(tuán)，不易成形；CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高時(shí)（＞1.4%），產(chǎn)品表層快速凝固，外層結(jié)構(gòu)致密，凝固劑不能很好地向內(nèi)層擴(kuò)散，導(dǎo)致內(nèi)層固化不充分，產(chǎn)品皮層偏薄，效果不佳。綜上所述，制備苦蕎黃酮微膠囊時(shí)，CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.4%最佳。

圖2 CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎黃酮微膠囊包埋率的影響Fig. 2 Effect of CaCl2 concentration on microencapsulation efficiency of tartary buckwheat flavonoids

2.3 攪拌時(shí)間對(duì)苦蕎黃酮微膠囊包埋率的影響

圖3 攪拌時(shí)間對(duì)苦蕎黃酮微膠囊包埋率的影響Fig. 3 Effect of stirring time on microencapsulation efficiency of tartary buckwheat flavonoids

由圖3可知，包埋率隨著對(duì)芯材與壁材混合液攪拌時(shí)間的不同呈先上升后下降的趨勢(shì)。經(jīng)差異性分析，40、50、60 min及70 min處理組分別與對(duì)照組（攪拌時(shí)間30 min）有極顯著差異（P＜0.01）。在30～50 min時(shí)，隨著混合液攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，包埋率有所增加，當(dāng)攪拌時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，出現(xiàn)包埋率隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)閿嚢杩赏ㄟ^(guò)力的作用促進(jìn)芯材的分散，在一定程度上乳化芯材，增大了芯材與壁材的接觸面，促進(jìn)PWP對(duì)苦蕎黃酮的包埋，當(dāng)攪拌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，容易出現(xiàn)分子鍵和氫鍵的破裂現(xiàn)象，對(duì)分子締合物的形成不利，造成包埋率降低[25]。所以選擇50 min為最佳攪拌時(shí)間。

2.4 苦蕎黃酮微膠囊工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面模型及方差分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。運(yùn)用Design-Expert 8.0.6程序軟件對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到苦蕎黃酮微膠囊包埋率（R）對(duì)芯壁比（A）、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、攪拌時(shí)間（C）編碼后的二次多項(xiàng)式回歸方程為R=92.54+1.14A+1.28B+1.67C+1.67AB+1.17AC+1.09BC-3.53A2-5.90B2-4.77C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface design with experimental and predicted values of microencapsulation efficiency

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

回歸模型中，通過(guò)F檢驗(yàn)分析各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響是否顯著，P值越低，顯著性越高。由表3可得，以微膠囊包埋率為響應(yīng)值時(shí)，交互項(xiàng)AC、BC對(duì)結(jié)果表現(xiàn)為顯著（P＜0.05）；一次項(xiàng)（A、B、C）、二次項(xiàng)（A2、B2、C2）及交互項(xiàng)AB均對(duì)結(jié)果有極顯著影響（P＜0.01）；在各因素交互作用下，對(duì)苦蕎黃酮微膠囊包埋率的影響大小依次為芯壁比×CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞芯壁比×攪拌時(shí)間＞CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)×攪拌時(shí)間；就各因素而言，對(duì)苦蕎黃酮微膠囊包埋率的影響大小順序?yàn)閿嚢钑r(shí)間＞CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞芯壁比。該回歸模型中P值小于0.000 1，表現(xiàn)為極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.822 6＞0.05），R2為0.989 9，大于0.95，為0.976 9，可見(jiàn)該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度較佳，誤差小，可用于PWP制備苦蕎黃酮微膠囊包埋率的理論預(yù)測(cè)。

2.4.2 各因素間交互作用響應(yīng)面分析

圖4 各因素交互作用對(duì)苦蕎黃酮微膠囊包埋率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on microencapsulation efficiency of tartary buckwheat flavonoids

由圖4可得，在各自變量的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)存在最大值，即微膠囊包埋率最高。根據(jù)響應(yīng)面與等高線圖特性觀察可知，芯壁比與CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間交互作用對(duì)包埋率的影響極顯著，等高線圖表現(xiàn)為橢圓形且曲面彎曲程度大、曲線陡；芯壁比與攪拌時(shí)間之間及CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)與攪拌時(shí)間之間的交互作用對(duì)包埋率的影響顯著，等高線圖表現(xiàn)為橢圓形，彎曲程度相對(duì)較小，坡度相對(duì)較緩。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6分析軟件求得PWP制備苦蕎黃酮微膠囊的最佳工藝參數(shù)為芯壁比1∶9.24（g/g）、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.43%、攪拌時(shí)間52.23 min，得苦蕎黃酮微膠囊包埋率為92.964 8%。實(shí)際操作時(shí)，根據(jù)所得最佳工藝參數(shù)進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得實(shí)際微膠囊包埋率為92.85%，同預(yù)測(cè)值的誤差為0.12%。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該響應(yīng)面所得最佳工藝參數(shù)穩(wěn)定可靠。

2.6 苦蕎黃酮微膠囊理化性質(zhì)分析

2.6.1 微膠囊包埋率、載藥量及水分含量的測(cè)定

使用PWP作為壁材料微膠囊化苦蕎黃酮，其包埋率高達(dá)92.85%，載藥量為9.29%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.10%。研究發(fā)現(xiàn)，微膠囊高包埋率可歸因于鈣誘導(dǎo)的PWP的緊密網(wǎng)絡(luò)以及苦蕎黃酮和暴露的乳清蛋白的疏水部分之間的強(qiáng)疏水相互作用[24]。研究表明，美國(guó)成年人黃酮攝入量為344.83 mg/d，愛(ài)爾蘭和英國(guó)成年人黃酮的平均攝入量分別為177 mg/d和182 mg/d，而我國(guó)人均黃酮攝入量尚未見(jiàn)報(bào)道[26]。張楠楠等[27]對(duì)天津市糖尿病患者黃酮攝入量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，男性黃酮攝入量為38.23 mg/d，女性為38.27 mg/d；郜明明等[26]調(diào)查發(fā)現(xiàn)鹽城市青春期女性黃酮攝入量為57.09 mg/d；高蔚娜等[28]報(bào)道了天津和杭州兩地55～82 歲成年人類(lèi)黃酮攝入量分別為67.21 mg/d和96.34 mg/d，由此，每日攝入2 g該苦蕎黃酮微膠囊產(chǎn)品即可有針對(duì)性的顯著提高我國(guó)部分人群的黃酮攝入水平。將該微膠囊產(chǎn)品添加入食品中，還可作為輔料生產(chǎn)功能性食品，供人們?nèi)粘Ｊ秤谩?/p>

2.6.2 微膠囊形態(tài)分析

圖5 苦蕎黃酮微膠囊形態(tài)分析Fig. 5 Morphological analysis of tartary buckwheat flavonoid microcapsules

按照最佳工藝制備的苦蕎黃酮微膠囊，呈現(xiàn)為圓整的球形狀態(tài)，粒徑分布比較集中，平均粒徑為（1 708.67±309.32）μm。由圖5a可以看出，微膠囊的形態(tài)良好，大小均一，乳白色，具有淡淡的乳香味，無(wú)不良感官性狀，符合微膠囊制備要求。由圖5b、c可知，其表面均勻疏松多孔，分析原因可能是游離的苦蕎黃酮與PWP溶液混合，PWP具有成膜性，當(dāng)冷凍干燥去除水分時(shí)，鈣離子-PWP微粒表面及內(nèi)部的水分均勻散失，進(jìn)而形成許多細(xì)小的孔洞，另有報(bào)道，其與PWP的濃度較高也有關(guān)[29]。

2.6.3 苦蕎黃酮微膠囊的紅外光譜分析

圖6 PWP微膠囊及其單體成分的紅外圖譜Fig. 6 Infrared spectra of free and microencapsulated tartary buckwheat flavonoids and PWP

紅外吸收光譜為振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)光譜。每個(gè)官能團(tuán)都有幾種振動(dòng)形式，在紅外區(qū)相應(yīng)產(chǎn)生幾個(gè)吸收峰，光譜復(fù)雜，特征性強(qiáng)。除了極個(gè)別化合物外，每個(gè)化合物都有其特征紅外光譜，因而紅外光譜是定性鑒別的有效手段[30]。由圖6A可知，由于苦蕎黃酮結(jié)合的糖上—OH的存在及黃酮自身含有許多酚羥基，在3 439.86 cm-1處有—OH締合而成的寬而強(qiáng)的特征峰，在2 930.18、1 399.63 cm-1處有較強(qiáng)的—CH2和—CH3伸縮振動(dòng)，說(shuō)明飽和碳上存在的氫較多，在1 645.20 cm-1處為C＝C的伸縮振動(dòng)，1 160.74 cm-1處為羥基的彎曲振動(dòng)，1 073.46 cm-1和1 013.65 cm-1處分別出現(xiàn)了C—O—C反對(duì)稱(chēng)及對(duì)稱(chēng)的伸縮振動(dòng)峰。根據(jù)圖6B紅外光譜分析可得，同圖6A相比，保留了苦蕎黃酮的特征峰，只是在3 407.22、2 940.79 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度減弱；1 073.46 cm-1和1 013.65 cm-1處C—O—C反對(duì)稱(chēng)及對(duì)稱(chēng)的伸縮振動(dòng)峰消失。這是由于游離苦蕎黃酮進(jìn)入PWP空腔后，導(dǎo)致振動(dòng)受限所引起的。如圖6C所示，其主要特征峰有3 419.09 cm-1處的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，2 978.40、1 537.93 cm-1和1 156.29 cm-1處的對(duì)稱(chēng)伸縮引起的強(qiáng)度較弱的窄峰，以及彎曲振動(dòng)引起的，在1 406.31 cm-1處的一個(gè)特征峰。分析圖6可得，PWP苦蕎黃酮微膠囊紅外圖譜中并未出現(xiàn)芯材與壁材中沒(méi)有的特征吸收峰，即在包埋過(guò)程中并未生成其他的化學(xué)鍵，僅為芯材與壁材間的靜電相互作用，而非化學(xué)反應(yīng)。Kakran等[31]對(duì)槲皮素的包埋也有相似的結(jié)果。

2.6.4 DSC分析

圖7 DSC分析圖Fig. 7 Differential scanning calorimetric analysis

DSC曲線分析可直觀地顯示樣品相轉(zhuǎn)變的起始溫度及熱分解溫度。在實(shí)際生活和生產(chǎn)中，產(chǎn)品的貯藏溫度必須低于玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度[32]。由圖7可知，PWP囊壁及其苦蕎黃酮微膠囊的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度分別為139.61 ℃和152.06 ℃，熱分解溫度分別為140.04 ℃和153.52 ℃。即在室溫下PWP苦蕎黃酮微膠囊可保持在穩(wěn)定的玻璃態(tài)，微膠囊分子表現(xiàn)為低流性，產(chǎn)品不會(huì)發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，產(chǎn)品囊壁的通透性較小，可有效保證芯材的性質(zhì)穩(wěn)定，防止?fàn)I養(yǎng)流失。同時(shí)有利于產(chǎn)品的保藏，延長(zhǎng)保質(zhì)期，提高產(chǎn)品品質(zhì)。

2.6.5 模擬體外胃腸道消化緩釋實(shí)驗(yàn)

對(duì)人體內(nèi)黃酮類(lèi)化合物代謝的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物主要由大量腸道菌代謝，發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，代謝產(chǎn)物經(jīng)吸收進(jìn)入人體血液循環(huán)[33]。因此應(yīng)保護(hù)微膠囊化的苦蕎黃酮免受胃液的影響，并在腸道中釋放，被人體充分吸收。設(shè)計(jì)苦蕎黃酮微膠囊體外模擬胃腸道消化時(shí)間為10 h（胃排空時(shí)間4 h、小腸排空時(shí)間6 h）。由圖8可知，在模擬體外胃液消化的4 h中，苦蕎黃酮釋放率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增大，最終在胃液中的釋放率僅為15.75%，釋放較少；當(dāng)苦蕎黃酮微膠囊產(chǎn)品處于模擬體外小腸液中時(shí)，僅在1 h內(nèi)釋放率就上升了50.24%（P＜0.01），并在小腸液中4 h內(nèi)快速釋放（P＜0.01），5～6 h趨于平緩（P＞0.05）并釋放完全。以上表明在模擬體外胃腸液消化4 h后，微膠囊囊壁逐漸降解，限制芯材釋放速率的障礙逐漸消失，向外擴(kuò)散速率增大，最終在小腸內(nèi)全部釋放。綜上，PWP作為苦蕎黃酮微膠囊的壁材，可有效保護(hù)苦蕎黃酮的生物活性，滿(mǎn)足苦蕎黃酮微膠囊所應(yīng)具備的特性，切實(shí)提高苦蕎黃酮在人體中的利用率。

圖8 PWP基苦蕎黃酮微膠囊模擬胃腸道消化緩釋分析Fig. 8 Sustained release performance of tartary buckwheat flavonoid microcapsules during simulated gastrointestinal digestion

3 結(jié) 論

利用銳孔-凝固浴法以熱誘導(dǎo)的PWP作為唯一壁材，苦蕎黃酮為芯材制備了苦蕎黃酮微膠囊。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為芯壁比1∶9.24（g/g）、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.43%、攪拌時(shí)間52.23 min，微膠囊包埋率達(dá)到92.85%，載藥量為9.29%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.10%。這與魯曉翔等[15]以β-環(huán)糊精為壁材制備的黃酮微膠囊包埋率85.5%、載藥量5.7%相比，PWP對(duì)黃酮的包埋率和載藥量均得到顯著提高。由PWP為壁材制備的苦蕎黃酮微膠囊產(chǎn)品呈圓整的球形狀態(tài)，形態(tài)良好，大小均一，乳白色，具有淡乳香味，無(wú)不良感官性狀。掃描電鏡結(jié)果顯示微膠囊表面疏松多孔且分布均勻。紅外光譜分析表明，苦蕎黃酮可被熱誘導(dǎo)的PWP有效包埋，且芯材與壁材間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，保證了苦蕎黃酮的天然性與完整性。苦蕎黃酮微膠囊具有良好的熱性質(zhì)，其玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度為152.06 ℃，高于常溫，可在常溫貯藏使用。使用PWP作為微膠囊化的壁材料可有效保護(hù)苦蕎黃酮免受胃液的破壞并在腸道中完全釋放。實(shí)驗(yàn)表明熱誘導(dǎo)的PWP可以作為苦蕎黃酮壁材使用，所得苦蕎黃酮微膠囊成球性較好，具有良好的緩釋性及定向釋放性，切實(shí)提高了人體對(duì)黃酮的利用率；乳清蛋白作為干酪加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，生物效價(jià)高，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源，對(duì)其進(jìn)行熱誘導(dǎo)用于微膠囊的制備，降低成本、解決環(huán)境污染問(wèn)題的同時(shí)，賦予了產(chǎn)品更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此，PWP有作為新型食品微膠囊壁材的極佳潛質(zhì)。