沈志燕，高云濤*，張海芬，蔣瓊芳，熊華斌

（云南民族大學化學與環(huán)境學院，云南省跨境民族地區(qū)生物質資源清潔利用國際聯合研究中心，生物基材料綠色制備技術國家地方聯合工程研究中心，云南 昆明 650500）

蜂花粉是工蜂采集花粉，用唾液和花蜜混合后形成的物質[1]，因其含有豐富的黃酮類化合物、氨基酸、不飽和脂肪酸和多糖等營養(yǎng)物質，被稱為天然的“微型營養(yǎng)庫”[2-4]。在諸多蜂花粉中，蕎麥蜂花粉具有消炎、治療和預防前列腺疾病等功能[5-7]。黃酮是蕎麥蜂花粉的主要活性成分，研究表明蜂花粉黃酮具有抗氧化、降糖、降脂等生物活性[8-12]，但由于花粉細胞外部有一層以孢粉素為主要成分的外壁，壁厚且具有耐溫、耐壓、耐酸、耐堿以及良好的抗胃酸和消化道酶特性，其中的有效成分難以被人體消化系統(tǒng)吸收利用[13-15]。阮征等[16]研究證實，破壁蜂花粉提取的總黃酮量較未破壁有明顯增加。

體外消化具有簡單、快速、成本低等優(yōu)點，可用于替代體內消化實驗而被廣泛應用[17-18]。

目前花粉破壁過程研究及破壁率計算通常以光鏡觀察為主，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）分辨率遠高于光學顯微鏡，有更大的景深和視野，在花粉微觀形態(tài)研究中展現了良好的應用前景。因此，本實驗擬建立蜂花粉破壁率的SEM測定方法，并利用體外消化模型測定了破壁對黃酮類化合物釋放的影響，探討破壁率與模擬胃腸液中黃酮類化合物釋放關聯關系，旨在建立1 種SEM和體外消化模型聯合研究方法，為蜂花粉破壁的深入研究及蜂花粉開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥蜂花粉 山西忻州五臺山蜂業(yè)有限公司蜂業(yè)基地；胃蛋白酶、胰蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；蘆丁標準品 天津市一方科技有限公司；磷酸二氫鉀、硝酸鋁、亞硝酸鈉等其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

NOVA NANOSEM-450型場發(fā)射SEM 美國FEI公司；TU-1950型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SJIA-2012聚能式超聲波細胞粉碎機（工作頻率：19～21 kHz，功率50～1 500 W可調）、變幅桿超聲換能器（鈦合金變幅桿+Φ20長鈦合金圓柱狀工具頭（直徑29.4 mm、高71.9 mm））；DC-2006循環(huán)式低溫恒溫槽（溫度控制-20～100 ℃，冷阱容量50～600 mL，冷媒：乙醇） 寧波市鄞州雙嘉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 聚能超聲破壁

稱取1.00 g研磨均勻的蕎麥蜂花粉樣品，放于100 mL燒杯中，加入一定量的蒸餾水，置于低溫恒溫槽外置冷阱中，冷阱中加入乙醇，設定燒杯中樣品的初始溫度，將變幅桿超聲換能器與超聲波細胞粉碎機連接，工具頭置入燒杯樣品中，采用脈沖處理方式，固定其他條件，設置超聲功率（100、200、300、400、500 W）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、通斷比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、2∶2、2∶3、2∶4）和初始溫度（0、5、10、15 ℃）進行超聲破壁處理，制得破壁蜂花粉溶液。

1.3.2 SEM分析

將2 μL超聲分散后的破壁花粉溶液滴加點在拋光單晶硅片上，60 ℃干燥，用雙面膠將該硅片固定于SEM載物臺，用離子濺射儀對破壁花粉樣品進行噴金處理，噴鍍電流10 mA，噴鍍2 次，每次50 s，用SEM觀察制備樣品的表面形貌。

1.3.3 體外腸胃消化模擬

參照文獻[19-20]方法，將1.0 g胃蛋白酶溶解于50.0 mL蒸餾水中，加入1.65 mL 10% HCl溶液，定容至100.0 mL，制得人工胃液。

稱取0.68 g磷酸二氫鉀溶于50.0 mL蒸餾水，用0.1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH 6.8，加入1.0 g胰蛋白酶，定容至100.0 mL，制得人工腸液。

取一定量破壁蜂花粉溶液，用1.0 mol/L的HCl溶液調節(jié)pH 2.0，加入20.0 mL人工胃液，于恒溫水浴搖床中37 ℃振搖70 min，消化結束后，取消化液4 000 r/min離心10 min，分離上清液，用NaOH調節(jié)pH 8.0，一份-20 ℃條件下保存待分析，另一份繼續(xù)進行腸液消化。

取上述胃消化液，用1.0 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH 8.0，加20.0 mL的人工腸液，于恒溫水浴搖床中37 ℃繼續(xù)模擬消化2 h，4 000 r/min離心10 min，分離獲得上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 樣品總黃酮釋放量和胃腸消化液吸收率測定

滅酶胃腸消化液中黃酮含量測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[21-22]。以蘆丁為標準品，黃酮含量以每克蜂花粉中所含蘆丁當量表示，單位為mg/g，根據滅酶胃腸消化液中黃酮含量計算破壁蜂花粉黃酮釋放量，如式（1）所示：

式中：ρ1為滅酶胃腸消化液中總黃酮質量濃度/（mg/mL）；V1為滅酶胃腸消化液總體積/mL；N為稀釋倍數；m為蕎麥蜂花粉樣品質量/g。

破壁蜂花粉黃酮釋放率按式（2）計算：

式中：W1為胃腸液中黃酮的釋放量/（mg/g）；W2為原蜂花粉中黃酮含量/（mg/g）。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上選取超聲時間（A）、超聲功率（B）、通斷比（C）和料液比（D）4 個因素，設置3 個水平，以蜂花粉破壁率為考察指標，設計L9（34）正交試驗優(yōu)化蕎麥蜂花粉破壁工藝條件。因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.4 數據分析

采用Origin 8.5軟件進行相關曲線擬合，得出線性方程及相關系數；通過Excel 2010軟件計算實驗結果以表示。

2 結果與分析

2.1 蕎麥蜂花粉破壁的SEM及破壁率測定結果

圖1 蕎麥蜂花粉破壁前后的SEM圖Fig. 1 SEM images of buckwheat bee pollen before and after wall breakdown

從圖1a可看出，蕎麥蜂花粉呈長橢球形，極軸方向分布有3 條萌發(fā)溝，萌發(fā)溝細長直達兩極，花粉粒外壁紋飾由呈網狀網脊與穴（或溝）構成三維結構，網穴具有溝狀孔。測量20 個蕎麥蜂花粉粒極軸長度（P）和赤道軸長度（E），計算其平均值，結果P為42.97 μm，E為22.31 μm，形態(tài)指數P/E反映了花粉的形狀，P/E越趨近于1，花粉越趨向于球形，P/E在1.2～1.6為橢球形，P/E高于1.6為長橢球形，蕎麥蜂花粉P/E為1.93（相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.24%），說明其蕎麥花粉為典型長橢球形形態(tài)，長橢球形形態(tài)是蟲媒花粉的特征[23]。

從圖1b～d可知，通過低溫聚能超聲破壁處理，蕎麥蜂花粉的破壁經歷了3 個過程：一是開裂，在外加聚能超聲作用下，花粉沿3 個萌發(fā)溝裂開（圖1b）；二是破裂，花粉繼續(xù)沿裂開的位置破裂成兩個部分（圖1c），最后是破碎，在聚能超聲進一步作用下，花粉破碎成若干碎片（圖1d）。從破壁后的蜂花粉（圖1b、c）可看出，蕎麥蜂花粉細胞具有由孢粉素、纖維素等致密物質構成[24]，外壁質地堅固，但3 條萌發(fā)溝是其外壁結構的薄弱點。結合圖1b～d，提出花粉的聚能超聲破壁機理是在聚能超聲變幅桿工具頭空化作用下，反應器液體中的氣泡急劇崩潰產生強大沖擊力，導致花粉從結構薄弱的萌發(fā)溝開裂、進而破裂和破碎的過程。

破壁率是評價花粉破壁效果的關鍵指標，光鏡視野中破壁籠統(tǒng)指花粉細胞破碎過程。但從SEM結果可知，在聚能超聲作用下，蜂花粉細胞經過開裂、破裂和破碎3 個階段，從圖1b可以看出，在開裂階段，花粉部分內含物質開始從裂口處向外溢出，腸胃消化液已可以通過破裂口進入花粉細胞內，吸收利用其內含有效成分，破裂和破碎階段（圖1c和圖1d），花粉內物質已幾乎完全從蜂花粉殘留塊釋放，因此，從人體腸胃系統(tǒng)利用角度看，開裂的花粉細胞可視為已經破壁。

圖2 樣品SEM圖Fig. 2 SEM images of samples

從圖2可看出，在不同的破壁處理條件下，破壁率不同，但每個視野中花粉細胞均出現如圖1的4 種形態(tài)，未破壁和沿萌發(fā)溝開裂的仍然保留蕎麥蜂花粉完整的3 瓣式結構，沿萌發(fā)溝破裂保留有2 瓣式結構，破碎通常保留完整的1 瓣或或少于1 瓣多個碎片結構。依據前述，視開裂的花粉細胞為已破壁，對于1 個視野，則：

為保證測定結果的準確可靠，破壁率的計算應選取多于5 個視野的平均結果，并計算RSD。

SEM的分辨率（低于1 nm）遠高于光學顯微鏡的分辨率（約200 nm），可觀察花粉細胞的亞顯微結構[25-27]。同時，SEM的景深較光學顯微鏡大幾百倍，視野更大，成像富有立體感，可更好觀察花粉細胞表面的細微結構，獲得更多破壁過程的微觀信息，更深入地認識花粉破壁機理。針對SEM視野中破壁蜂花粉細胞呈現的多種形態(tài)，本實驗亦提出了更加精準的破壁率計算方法。

2.2 初始溫度對破壁率的影響

蜂花粉具有異常堅韌抗化學腐蝕的細胞外壁[28]，為釋放其黃酮等活性成分，并更好觀察內部結構。采用變幅桿聚能超聲破壁的方式，超聲能量集中在較小的面積，為避免聚能超聲導致體系高溫對黃酮等熱敏物質的破壞，采取低初始溫度及脈沖式超聲作用方式。首先研究了初始溫度對破壁的影響，結果見圖3，較低溫度有利于花粉破壁，初始溫度的升高可導致花粉破壁率呈線性下降，變化幅度約為-1%/℃，原因在于低溫可使蜂花粉細胞壁變脆，有利于破壁[29]，反之，較高溫度可使花粉細胞壁彈性和韌性增加[30]?？紤]到溫度降低至0 ℃以下，可致體系結冰不利于操作，選擇初始溫度為0 ℃。

圖3 初始溫度對破壁率的影響Fig. 3 Effects of initial temperatures on wall breakdown

2.3 超聲條件對破壁率的影響

基于上述研究，固定其他條件，改變超聲功率，破壁率隨著超聲功率增加而增加，400 W時破壁率達到最大，但超聲功率超過400 W時，破壁率反而降低，可能的原因是超聲功率過大體系升溫速率較快使花粉細胞壁彈性和韌性增加不利于破壁，選擇超聲功率為400 W。在前述選擇條件下，進一步研究超聲作用時間對破壁率的影響，隨著超聲作用時間延長，破壁率逐漸增大，但因為聚能超聲作用方式可導致體系升溫速率過快，終點溫度較高，對釋放的黃酮存在一定破壞作用，因此超聲時間應該控制在50 min之內。

當超聲功率400 W、樣品量1.00 g、料液比1∶30（g/mL）、施加功率相當于400 W/g（以樣品質量計）、超聲時間30 min，進一步研究超聲脈沖方式的影響，脈沖作用大于2 s，樣品溶液升溫較快，而脈沖作用為1 s，當通斷比≤1∶4（脈沖作用1 s，休止4 s）時，破壁率低于70%，尚不能獲得最佳破壁效果，當通斷比為1∶2（脈沖作用1 s，休止2 s）時，破壁率已大于85.91%接近最佳，且終點溫度較低，當通斷比大于2∶3時，破壁率雖大，但終點溫度明顯較高，因此，選擇脈沖作用1 s，通斷比為1∶2。

2.4 正交試驗結果

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2可知，4 個因素影響主次順序依次為：C＞B＞A＞D，即通斷比＞超聲功率＞超聲時間＞料液比。正交試驗結果顯示蕎麥蜂花粉破壁的最佳條件為A2B2C3D2，該條件下終點溫度較高，對釋放的黃酮有一定破壞作用，因此，選擇蜂花粉破壁的最佳條件為A2B2C1D2，即初始溫度0 ℃、超聲功率400 W、脈沖通斷比1∶2、超聲時間30 min、料液比1∶30（g/mL），在此條件下，蜂花粉破壁率達到（98.33±4.02）%。

2.5 不同條件蕎麥蜂花粉破壁及黃酮在模擬腸胃液中的吸收

圖4 不同條件蕎麥蜂花粉破壁SEM圖Fig. 4 SEM images showing different degrees of wall disruption of buckwheat bee pollen

在單因素及正交試驗研究的基礎上，通過控制初始溫度，選取強度不同的破壁條件（表3）（破壁率由低到高）對蕎麥蜂花粉破壁處理，破壁條件由弱至強分別為a＜b＜c＜d，隨著破壁強度增加，蜂花粉破裂程度依次增強，結果見圖4。在低倍率500 倍進行SEM分析，計算5 個視野下的破壁率，結果見表3，在4 個不同強度的破壁條件下考察破壁率與蜂花粉黃酮在模擬腸胃液中釋放量的關聯關系，從表3可以看出，隨著破壁率的增加，黃酮在模擬腸胃液中的釋放量依次增加，表明蜂花粉破壁更有利于花粉中營養(yǎng)物質的釋放，且不同強度的破壁率所對應的RSD均在5%以內，精密度較好。

表3 破壁率測定結果及黃酮在模擬腸胃液中的釋放量（n＝5）Table 3 Wall disruption rate and amount of flavonoids released when incubated in simulated gastrointestinal fluid (n= 5)

在表3基礎上，根據式（2），進一步計算上述破壁條件下模擬腸液和模擬胃液對破壁蕎麥蜂花粉中黃酮的釋放率，不同破壁條件下模擬腸液和模擬胃液的釋放率與破壁率的關系見圖5，不同的破壁條件下，蜂花粉中黃酮的釋放率不同，隨著破壁率的增加，花粉中黃酮在模擬腸液和模擬胃液中的釋放率和總釋放率依次增加，破壁率與模擬腸液和模擬胃液中的釋放率和總釋放率具有很好的線性關系，破壁率與總釋放率線性方程為y＝0.363 8x+27.172，R2＝0.999 7，表明破壁能有效促進蜂花粉細胞內營養(yǎng)成分在腸胃液中的釋放。

圖5 破壁率與黃酮釋放率的線性關系Fig. 5 Linear correlation between wall disruption rate and flavonoids release rate

3 結 論

本實驗采用SEM法研究蕎麥蜂花粉低溫聚能超聲破壁微觀過程，提出聚能超聲變幅桿工具頭空化作用產生的沖擊力，使蕎麥蜂花粉結構薄弱的萌發(fā)溝開裂、進而破裂和破碎的破壁機理；從結果可知，相對于傳統(tǒng)的光鏡，SEM分辨率高，能清晰觀察物體的表面結構，立體感強、圖像直觀，可獲得更多花粉破壁過程的微觀信息，有助于對花粉破壁機理進行更深入的研究。針對破壁過程蜂花粉細胞呈現的開裂、破裂和破碎等多種微觀形態(tài)導致破壁率難以準確計算的問題，提出SEM視野中破壁蜂花粉復雜微觀形態(tài)下的破壁率計算方法，使破壁率計算結果更加精準（RSD＜5%，n＝5）；由單因素及正交試驗優(yōu)化得到破壁最佳條件，發(fā)現較低初始溫度有利于花粉破壁，破壁率與蜂花粉細胞內黃酮在模擬腸胃液中的釋放量具有較明顯的關聯關系，破壁有效促進了蜂花粉中營養(yǎng)物質的釋放。本實驗對研究花粉破壁提出了一種新穎的思路，具有較好的應用前景。