蔣立文 謝艷華 李 跑 陳力力 周紅麗 陳 怡

(1湖南農業(yè)大學食品科學技術學院,湖南 長沙 410128；2食品科學與生物技術湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410128)

豆豉是我國具有名族特色的傳統(tǒng)發(fā)酵調味品。毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中,在以毛霉為主及其他微生物多種酶的作用下[1],發(fā)生了碳水化合物、蛋白質和脂肪等大分子物質降解和后發(fā)酵期間復雜的分解合成等反應,產生了醇類、酯類等多種風味物質及風味成分前體物質[2-3]。不同發(fā)酵階段的揮發(fā)性成分有差異,不同階段揮發(fā)性成分對毛霉型豆豉香氣、滋味影響較大。目前評價豆豉的品質風味仍以人為感官評價為主,該方法無法避免個人喜好等缺陷,不能客觀有效地對豆豉風味品質進行評價。近年來,雖然國內外學者對豆豉進行了研究,但主要集中在豆豉風味物質[4-5]、豆豉工藝[6-9]等方面,仍然不夠系統(tǒng)。

為了探討不同發(fā)酵階段毛霉型豆豉風味品質的差異,本研究對發(fā)酵過程中毛霉型豆豉風味品質變化進行了客觀有效的評價,以不同發(fā)酵階段的毛霉型豆豉為樣本,采用頂空固相微萃取/氣相色譜-質譜法(headspace holid phase microextraction/gas chromatograohy-mass spectrometry,HS-SPME/GC-MS)與電子感官技術相結合的方法,分析毛霉型豆豉不同發(fā)酵時期樣品的揮發(fā)性成分和不同發(fā)酵樣品的氣味和滋味,以期為毛霉型豆豉質量控制及品質分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆、食鹽、白酒一般采購符合食品加工要求,食鹽為食用鹽,白酒為邵陽大曲,50 度(v/v)。原料黃豆為當地市售非轉基因黃豆,

乙醚、濃硫酸、甲醇溶液(色譜純)、正己烷(色譜純)、無水硫酸鈉(分析純)、KOH(分析純)、磷酸,均購自國藥集團化學試劑有限公司；2-甲基戊酸,購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司；短中鏈游離脂肪酸標準品(乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、戊酸、正己酸、正庚酸、正辛酸、正癸酸)、37 種脂肪酸甲酯混標儲備液、有機酸標準品(酒石酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、丁二酸、富馬酸),均購自美國西格瑪奧德里奇公司；環(huán)己酮,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 主要儀器與設備

57330-U 固相微萃取裝置(包括手柄、導向桿)SPME 進樣器,上海安譜科學儀器有限公司；75 μm 聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)萃取頭,美國SUPELCO 公司；GCMS-QP2010 型氣相色譜-質譜聯用儀,日本SHIMADZU(島津)公司；PEN3 電子鼻和TS5000Z 電子舌,北京盈盛恒泰科技有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆豉工藝流程及取樣 毛霉型豆豉樣品制備：黃豆精選去雜→浸泡12 h→熟化(121℃、20 min)→冷卻→接種1%純種毛霉菌(CGMCC8700),經過擴大培養(yǎng)→前發(fā)酵(15℃、64 h)→加入9%食鹽、5%白酒→45℃密封后發(fā)酵42 d→成熟。前發(fā)酵取樣時間為0、16、32、48、64 h,后發(fā)酵取樣時間為0、7、14、21、28、35、42 d。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 HS-SPME/GC-MS 測定揮發(fā)性成分 HSSPME 方法萃取樣品揮發(fā)性成分,將黑色75 μm Carboxen/PDMS 萃取頭在GC 進樣口溫度為270℃的條件下老化0.5 h,備用；將不同發(fā)酵時期的豆豉樣品(共12 個樣品)進行研磨,分別取研磨后的豆豉樣品約2 g 于15 mL 頂空進樣瓶中,加入0.4 μL 0.946 mg·mL-1環(huán)己酮標準品和4 mL 超純水,用密封墊和蓋帽進行密封；然后在60℃條件下利用磁力攪拌器(轉速300 r·min-1)預熱20 min,將已活化的萃取頭穿過密封墊插入頂空進樣瓶內后推出纖維頭,露出纖維頭距離樣品液面約10 mm,頂空吸附40 min,插入GC 進樣口解析6 min。

氣相色譜條件：CD-WAX 石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；載氣：高純氦氣(99.999%),流速1.0 mL·min-1；進樣口溫度：250℃；不分流進樣。升溫程序：柱溫45℃,保持2 min,以5℃·min-1升至150℃,然后以15℃·min-1升至290℃。

質譜條件：離子源EI,溫度200℃；發(fā)射電流150 μA；倍增器電壓1 037 V；萃取頭接口溫度220℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍45～500 amu。

定性定量分析：采用NIST2 014s 標準質譜庫檢索,相似度在80%以上作為有效峰面積進行分析處理,根據保留時間確定不同發(fā)酵階段毛霉型豆豉樣品揮發(fā)性成分,用峰面積歸一化法進行相對含量分析,用環(huán)己酮做內標進行揮發(fā)性成分定量分析。

1.3.2.2 電子鼻測定氣味強度的變化 分別稱取不同發(fā)酵階段的豆豉樣品3.0 g,裝入密封塑料杯中,室溫平衡30 min 后,插入電子鼻的進樣針頭進行測定。測定條件：采樣時間1 s/組；傳感器自清洗時間120 s；傳感器歸零時間10 s；樣品準備時間5 s；進樣流量400 mL·min-1；分析采樣時間120 s。采用電子鼻內置程序(Winmuster,version 1.6.2)進行數據處理與分析。

1.3.2.3 電子舌測定滋味 分別稱取5 g 研磨后的11 個不同發(fā)酵階段豆豉樣品,用20 mL 超純水在50℃水浴中提取1 h,然后4 000 r·min-1離心20 min,取上清液作為待測樣液,用于電子舌檢測。電子舌傳感器名稱包括鮮味傳感器、咸味傳感器、酸味傳感器、苦味傳感器、澀味傳感器、甜味傳感器,分別對應基本味(相對值)為鮮味、咸味、酸味、苦味、澀味、甜味；對應的回味(CPA 值)為鮮味豐富度、無、無、苦味回味、澀味回味、無。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME/GC-MS 分析豆豉不同發(fā)酵階段揮發(fā)性成分分析

由表1可知,前發(fā)酵毛霉型豆豉樣品共檢出23 種揮發(fā)性成分,其中酯類5 種、醛類1 種、醇類11 種、酮類2 種、其他類4 種。熟化黃豆(前發(fā)酵0 h)中含有10 種揮發(fā)性成分,前發(fā)酵16 、32 、48 h 和前發(fā)酵結束時(64 h),揮發(fā)性成分的種類分別為11、13、7 和15種。前發(fā)酵是毛霉生長和酶系形成的時期,以毛霉特有的氣味成分如1-辛烯-3-醇、異戊醇、乙醇為主。

毛霉型豆豉風味物質形成主要在后發(fā)酵時期,且與后發(fā)酵時間密切相關。由表2可知,后發(fā)酵7 個時期的揮發(fā)性成分總數量分別為15、24、27、27、30、30、31 種,總含量隨著發(fā)酵時間延長呈先增加后降低并趨于穩(wěn)定的趨勢。

酯化反應是發(fā)酵豆豉產生香氣的主要途徑之一,由豆豉中游離脂肪酸、有機酸等酸類物質與醇類反應生成。酯類物質在毛霉型豆豉的發(fā)酵過程中總含量第二,其含量高于醛類、酸類等。后發(fā)酵14 d 時豆豉酯類含量高達41.81 μg·g-1,是發(fā)酵終止期(42 d)的3.13 倍,是后發(fā)酵0 d 的232.28 倍。酯類香氣成分具有氣味清、飄散快、易察覺的特征,毛霉型豆豉發(fā)酵過程中主要酯類物質有乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯等,且己酸乙酯含量在后發(fā)酵14 d 時最高,與陶湘林等[6]的研究結果相似,達到23.30 μg·g-1；乙酸乙酯賦予毛霉型豆豉果香氣息[10]；丁酸乙酯在豆豉后發(fā)酵成熟過程(28～42 d)中含量變化較為平穩(wěn),維持在1.00 μg·g-1左右,其具有強烈的甜果香、香蕉、鳳梨和蘋果氣息,帶玫瑰香氣,味甜[11]。含量相對較低的戊酸乙酯賦予毛霉型豆豉甜、水果香氣[12]。

表1 毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分變化Table 1 Changes of volatile components content of Mucor-type Douchi during pre-fermentation /(μg·g－1)

醇類物質在毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中共檢出25種,含量高于其他類物質。醇類物質的產生主要與微生物代謝和后發(fā)酵期白酒或醪糟加入有關,使得毛霉型豆豉后發(fā)酵階段乙醇含量較高,后發(fā)酵7 d 后各階段均維持在23.00 μg·g-1以上。乙醇本身幾乎無味,但會增加毛霉型豆豉的刺激感和濃郁度。異戊醇略帶刺激性滋味,其含量僅次于乙醇。正己醇含量雖然不高,但其嗅覺閾值較低具有淡青嫩葉氣息,略帶酒香、果香和脂肪氣息等風味特征[13]。不飽和醇類的香氣閾值較低,對豆豉風味貢獻較大,其中1-辛烯-3-醇又稱松蕈醇,具有強烈的藥草香韻,近似于玫瑰、薰衣草和干草的香氣[14]。

醛、酮、酸類物質在后發(fā)酵階段揮發(fā)性成分中總含量雖然較低,卻是豆豉風味構成不可缺少的一部分[15-17]。在后發(fā)酵階段醛類物質與酸類物質含量相當,但醛類物質種類高于酸類物質,醛類物質香氣濃烈,多為花香及果香氣味,微量的醛在毛霉型豆豉香氣中起到調和作用。后發(fā)酵0～14 d 是醛類物質的生成階段,在后發(fā)酵7 和14 d 時其總含量較高,且總含量均在1.50 μg·g-1以上。后發(fā)酵14～35 d 醛類物質開始降解,其含量下降至0.40 μg·g-1,最后進入到物質再平衡階段,與后發(fā)酵35 d 相比發(fā)酵終止時其含量升高了0.03 μg·g-1。己醛作為亞油酸的代謝產物,具有一定的油脂味和腥味[18]。酮類物質性質穩(wěn)定且香氣持久,具有果香氣味[19]。

毛霉型豆豉在后發(fā)酵階段中酸類物質主要有乙酸、己酸和正戊酸,乙酸濃度較高時具有強烈、刺激性的特有氣味,濃度適中時顯酸味。后發(fā)酵14 d 以內脂質在水解酶的作用下不斷產生酸類物質,在后發(fā)酵14 d 時達到1.35 μg·g-1。在檢測到的3 種酸類物質中,己酸對酸味貢獻最大,與生成己酸乙酯體現醬香味有關[20]。

毛霉型豆豉在后發(fā)酵35 d 時揮發(fā)性成分種類數量與后發(fā)酵42 d 時相差不大,但總含量比后發(fā)酵42 d高4.93 μg·g-1。后發(fā)酵35 d時豆豉中揮發(fā)性風味物質如酯類、醇類物質的含量高于后發(fā)酵42 d 的樣品。綜合表明,恒溫發(fā)酵35 d 時豆豉風味基本穩(wěn)定,繼續(xù)發(fā)酵會影響產品的風味。

表2 毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分含量變化Table 2 Changes of volatile components content of Mucor-type Douchi during post-fermentation /(μg·g－1)

表2(續(xù))

2.2 電子鼻分析不同發(fā)酵階段氣味強度的變化

電子鼻作為一種電子感官分析方法,其可以獲得與樣品中揮發(fā)性化合物相關的所有信息[21]。由圖1可知,前發(fā)酵0～64 h 由于風味物質較少傳感器響應值較低。到45℃恒溫發(fā)酵后,各類酶解反應和綜合反應加速,風味物質快速形成,10 個傳感器感應值也明顯升高。由前面測定結果可知,后發(fā)酵階段增加了乙酸乙酯、己酸等9 種揮發(fā)性成分,揮發(fā)性成分總含量增加了4.6 倍,該結果在圖1 中得到驗證。后發(fā)酵階段樣品的傳感器R6(對甲烷靈敏)的響應值最大,其次為R8(對乙醇靈敏)、R9(對有機硫化物靈敏)、R7(對硫化物靈敏)。后發(fā)酵過程中由于白酒的加入,在后發(fā)酵7 d 時乙醇含量是后發(fā)酵0 d 的3.1 倍,這與加入白酒后的再平衡有關[22]。后發(fā)酵過程中產生了大量酯類物質,推測R6 傳感器很可能對酯類風味成分靈敏。其余6 個傳感器感應值較低,對區(qū)分不同發(fā)酵時期的毛霉型豆豉的香氣變化影響較小。

圖1 毛霉型豆豉發(fā)酵過程中10 個傳感器的響應值Fig.1 Response values of ten sensors to Mucor-type Douchi during fermentation

毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段的電子鼻主成分分析(principal component analysis,PCA)結果見圖2。主成分的累積貢獻量為99.88%,大于95%,干擾較小,說明PCA 適用于不同發(fā)酵時期毛霉型豆豉電子鼻感應值分析。此外,毛霉型豆豉11 個樣品可以分為兩類,其中前發(fā)酵5 個樣品為一類,后發(fā)酵6 個樣品為一類,表明毛霉型豆豉前發(fā)酵與后發(fā)酵階段樣品氣味差異明顯,與揮發(fā)性成分測定結果一致。熟化黃豆揮發(fā)性成分總含量僅為6.48 μg·g-1,所以前發(fā)酵過程中5 個樣品中發(fā)酵0 h 樣品與其余4 個樣品相距較遠。前發(fā)酵48 h 樣品位于發(fā)酵0 h 樣品和其余3 個前發(fā)酵樣品之間,說明前發(fā)酵48 h 樣品與其余4 個樣品的風味有共性；后發(fā)酵6 個樣品呈聚集狀態(tài),且除后發(fā)酵42 d 樣品外其他后發(fā)酵5 個樣品重疊部分較多,表明后發(fā)酵樣品具有較多共性物質。由表2可知,后發(fā)酵共有的酯類風味成分有乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯和L(-)-乳酸乙酯；共有的醛類風味成分有己醛和3-甲硫基丙醛；同時含有己酸和乙酸等酸類風味成分；且均存在較多的乙醇、4-甲基-3-庚醇、1-辛烯-3-醇、異戊醇、2-乙基己醇等醇類風味成分,這些共性物質的存在說明后發(fā)酵是一個風味緩慢形成的過程。

圖2 毛霉型豆豉不同發(fā)酵時期電子鼻的PCA 累計圖Fig.2 PCA plot of Mucor-type Douchi samples taken at differentfermentation stages by E-nose

2.3 電子舌對不同發(fā)酵階段滋味變化分析

電子舌以基準溶液(人工唾液)的輸出為無味點,由于基準溶液中含少量鹽和酸,因此鹽味和酸味的無味點分別為-6 和-13[23],其他味覺值指標的無味點均為0。由表3可知,前發(fā)酵64 h 過程中無味點以下的指標是酸味,即前發(fā)酵過程中無明顯人的味覺無法感知的酸味。這說明前發(fā)酵過程中代謝相對較少,以毛霉生長并形成酶系為主,因此該階段樣品甜味、苦味及澀味較明顯,回味和豐富性較差。

表3 毛霉型豆豉前發(fā)酵過程中滋味味覺變化Table 3 Changes of taste value of Mucor-type Douchi during pre-fermentation

由表4可知,豆豉后發(fā)酵0～7 d,味覺值發(fā)生較大幅度變化。由于后發(fā)酵階段加入了9%食鹽和一定比例白酒,加之密封發(fā)酵有一個平衡過程,其鹽味值從無激變到8.46,各種大分子物質進入再平衡階段,豆豉的鹽味值也得到平衡,其發(fā)酵成熟的鹽味值為8.15,鹽度適口。后發(fā)酵階段豆豉的酸味值均低于-13,表明在豆豉正常發(fā)酵過程中均不存在人體味覺能夠感知的酸味,這與謝靚等[24]的研究結果一致。進入后發(fā)酵階段豆豉的苦味和澀味均大幅降低,分別降低了82.3%和91.6%,由于霉菌產生的亮氨酸氨肽酶對大豆多肽有很明顯的脫苦效果[25],且亮氨酸氨肽酶與毛霉脯氨酸氨肽酶之間存在一定的底物選擇互補,所以提高了脫苦效率[26]。毛霉型豆豉后發(fā)酵加入食鹽和白酒進行調味同時酶活性緩慢釋放,有機酸、氨基酸、多肽、低分子糖類等呈味物質緩慢生成,使得毛霉型豆豉的滋味豐富性大幅度提升,與前發(fā)酵階段相比增加52.65%,甜味、苦味回味等感受值有所降低。在后發(fā)酵42 d 時,豆豉的苦味和澀味均維持在人體口感能夠接受的范圍之內,苦味回味與發(fā)酵時間呈反比。在發(fā)酵成熟時,苦味降低,后發(fā)酵階段澀味回味值一直維持在0.30 左右,使豆豉達到一個良好的口感[27-28]。在各種味覺的共同作用下,形成了毛霉型豆豉咸、鮮、回味豐富而獨特的風味。

表4 毛霉型豆豉后發(fā)酵過程中滋味味覺值變化Table 4 Changes of taste value of Mucor-type Douchi during post-fermentation

圖3 毛霉型豆豉不同發(fā)酵時期電子舌的PCA 累計圖Fig.3 PCA plot of Mucor-type Douchi samples taken at different fermentation stages by E-tongue

圖3 為毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段的電子舌主成分分析圖,圖中每個數軸所顯示的數值代表了電子舌每個傳感器在每個數軸上的信息量,也叫做“成分”。主成分的累積貢獻量為99.82%,說明其保留了原始數據大部分信息量,第一主成分貢獻率89.50%,表明不同發(fā)酵時期毛霉型豆豉滋味間具有相同的信息量較大。從分布的區(qū)域來看不同發(fā)酵階段樣品共分為4類,前發(fā)酵0 h 豆豉樣品甜味值較高、豐富性較低,被單獨分為一類；前發(fā)酵16～48 h 樣品滋味變化緩慢,為第二類；前發(fā)酵64 h(后發(fā)酵0 d)樣品澀味回味、苦味回味增加、甜味降低,被分為第三類；后發(fā)酵7 d 至發(fā)酵結束為各種味覺相互協調和平衡的階段,聚集為第四類。

由表5可知,不同階段豆豉滋味的變化主要體現在甜味、豐富性、苦味回味和澀味回味上。由表4 和表5可知,毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中甜味值下降,進入后發(fā)酵階段人體味覺無法感知到甜味；但后發(fā)酵階段分解、復合反應代謝產生了大量的醇類、酯類等物質,有文獻報道毛霉型豆豉產品酯類、酸類、醛類、醇類、酮類、酚類和吡嗪類化合物含量高[29-32],即豐富性較好,電子舌測定滋味發(fā)現發(fā)酵使豆豉豐富性增強,說明HS-SPME/GC-MS 結合電子舌能夠有效分析毛霉型豆豉發(fā)酵過程中風味變化。

表5 滋味指標貢獻值Table 5 Contribution rates of taste properties

后發(fā)酵35 d 樣品與后發(fā)酵42 d 樣品均為毛霉型豆豉成品,后發(fā)酵35 d 成品鮮味、豐富性和苦味回味均優(yōu)于后發(fā)酵42 d 成品,且鹽味值比后發(fā)酵42 d 樣品低0.07,口感更加柔和。結合感官評價結果認為,后發(fā)酵35 d 樣品苦味適度,滋味最佳。

3 討論

發(fā)酵大豆制品營養(yǎng)功能性已引起研究學者關注,但生產過程控制依賴經驗性、品質不穩(wěn)定仍是該行業(yè)發(fā)展的瓶頸。本試驗將HS-SPME/GC-MS和電子感官技術相結合來研究豆豉發(fā)酵過程中風味、滋味變化,為豆豉生產過程的標準化、可控化提供了重要的方法和依據。這也與陳辰等[33]和胡榮鎖等[34]采用HSSPME/GC-MS和電子感官技術評價產品滋味和風味變化結果一致。由此說明結合HS-SPME/GC-MS和電子感官技術對產品品質進行綜合分析具有較高的可行性和可靠性。

本研究采用HS-SPME/GC-MS和電子感官技術對毛霉型豆豉發(fā)酵過程中風味和滋味相聯系進行綜合評價,確定豆豉在保溫發(fā)酵過程中風味變化與滋味變化的趨勢,為豆豉生產過程中品質和質量標準的建立奠定了基礎。下一步研究應進一步建立數據模型找到毛霉型豆豉風味指紋圖譜中品質風味密切相關的風味物質并確定風味閾值范圍,建立理化指標基礎上的風味指標、滋味評價指標,為數字化控制傳統(tǒng)生產工藝奠定更好的基礎,為傳統(tǒng)發(fā)酵食品產業(yè)技術升級提供科學依據。

4 結論

本研究采用HS-SPME/GC-MS 結合電子舌、電子鼻分析了毛霉型豆豉發(fā)酵過程中的風味品質,HSSPME/GC-MS 結果表明,11 個豆豉樣品在前發(fā)酵與后發(fā)酵的過程中共檢測鑒定出68 種揮發(fā)性成分,其中酯類18 種、醛類7 種、酸類3 種、醇類26 種、酮類4 種、其他類10 種。電子鼻分析發(fā)現毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中的氣味隨著發(fā)酵時間延長不斷豐富化并趨于穩(wěn)定。利用電子舌可以高效地辨別豆豉后發(fā)酵不同時期的滋味變化,不同發(fā)酵時間的豆豉味覺差異主要在甜味、豐富性、苦味回味和澀味回味上。結合風味物質變化和滋味變化認為,保溫條件下豆豉后發(fā)酵35 d 趨于成熟,是毛霉型豆豉品質最佳點。本研究通過HSSPME/GC-MS 結合電子鼻、電子舌對毛霉型豆豉發(fā)酵過程中風味進行綜合評價,為毛霉型豆豉生產標準化可控化數字化控制提供了重要參考。