吳媛媛 吳偉杰 郜海燕 孫 健 劉瑞玲 陳杭君 韓延超

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210012；2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021；3廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣西 南寧 530070)

灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)屬半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)葡萄孢屬(Botrytis),是一種植物病原真菌。由灰葡萄孢霉引起的灰霉病是造成草莓[1]、藍(lán)莓[2]等水果采前和采后損失的重要原因?；移咸焰呙怪虏∵^程較復(fù)雜,病原菌入侵植物,首先需要分泌水解酶來突破其表皮的第一道屏障——角質(zhì)層[3],角質(zhì)層破損后病原菌進(jìn)一步生長(zhǎng),從而導(dǎo)致植物組織腐爛。通常角質(zhì)以C16和C18為底物通過酯鍵連接形成,是一種高聚物[4],而角質(zhì)酶夠分解角質(zhì)、甘油三酯等化合物并產(chǎn)生大量脂肪酸[5],因此角質(zhì)酶是入侵植物最主要的功能酶[6]。角質(zhì)酶也是誘導(dǎo)酶,經(jīng)其降解的角質(zhì)單體能夠誘發(fā)病原細(xì)胞中角質(zhì)酶基因的持續(xù)表達(dá)并分泌更多角質(zhì)酶,因此寄主體表的角質(zhì)被降解后,更易受到病原菌侵染[7]。

角質(zhì)酶能影響并削弱寄主抗病性,是果實(shí)采后保鮮技術(shù)的關(guān)鍵控制點(diǎn)。開展角質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)的研究,在果實(shí)貯藏過程中采取相關(guān)措施來抑制角質(zhì)酶活性,有助于保護(hù)果實(shí)角質(zhì)層,從而減小灰葡萄孢霉對(duì)果實(shí)的危害。目前,針對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)及其對(duì)葡萄角質(zhì)層降解作用的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)探究了灰葡萄孢霉角質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度、最適pH 值、熱穩(wěn)定性、pH 值穩(wěn)定性以及金屬離子和有機(jī)溶劑對(duì)其粗酶活性的影響,并分析角質(zhì)酶粗提液對(duì)葡萄角質(zhì)層的降解作用,以期為控制果蔬采后病害,探究植物角質(zhì)層與抗病性的關(guān)系提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)分離自藍(lán)莓,由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定和保存[2]。

蘋果及葡萄均購(gòu)于杭州市江干區(qū)石橋路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DHG-9070A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌器,松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；MIR-253 恒溫培養(yǎng)搖床、MIR-253 真菌恒溫培養(yǎng)箱,SANYO Electric Co.Ltd；MSZCL-1 磁力攪拌器,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司；E-103E分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司；Cintral 20 紫外-可見分光光度計(jì),澳大利亞GBC 科學(xué)儀器公司；BIOFUGE Stratos 高速低溫冷凍離心機(jī),美國(guó)Thermo公司；KYKY SBC-12 離子衍射儀,北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；TM3000 型掃描電鏡,日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果角質(zhì)的制備 取適量蘋果表皮浸泡于草酸緩沖液(草酸4 g·L-1和草酸銨16 g·L-1),煮沸1 h,煮沸后用蒸餾水徹底沖洗蘋果表皮,以除去草酸緩沖液。處理后的蘋果表皮置于50℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥3 h,取出后用研缽研磨成粉末。取適量蘋果皮粉末,加入氯仿-甲醇(2∶1,v/v)過夜提取,然后用分液漏斗萃取24 h,取下層萃取液,待萃取液揮發(fā)至干即得角質(zhì)[8]。

1.3.2 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶培養(yǎng)液制備 分別稱取0.6 g NaNO3、0.6 g K2HPO4、0.2 g MgSO4、0.2 g KCl、0.01 g FeSO4·7H2O 及0.2%蘋果角質(zhì),用蒸餾水定容至1 000 mL[9],配制成角質(zhì)酶培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液分裝至250 mL 三角瓶中,裝液量為100 mL,經(jīng)121℃濕熱滅菌25 min 后備用。

1.3.3 角質(zhì)對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶的誘導(dǎo) 參照王飛[8]的方法。從已分離鑒定的灰葡萄孢菌種上挑取少量菌絲,接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中22℃恒溫培養(yǎng)。取培養(yǎng)7 d 的灰葡萄孢霉,制成濃度為1×106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。取10 mL 孢子懸浮液接種于1.3.2 制備的培養(yǎng)液中,然后置于25℃條件下120 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)6 d。每隔1 d 取10 mL 灰葡萄孢霉培養(yǎng)液,用4 層紗布過濾除去菌絲,然后于4℃條件下10 000 r·min-1離心20 min,保留上清液,即為灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶液。

1.3.4 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶酶活的測(cè)定 取200 μL 粗酶提液,加入200 μL 0.4%Triton X-100 和1 380 μL 50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH 值7.0),混合后于35℃條件下水浴2 min,再加入20 μL 丁酸對(duì)硝基苯酯(p-nitrophenyl butyrate,PNB)作為反應(yīng)底物,于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄3 min 內(nèi)反應(yīng)液的吸光度值的變化速率[10]。以直接沸水浴5 min 處理后的粗酶液為對(duì)照。以35℃時(shí)每分鐘催化PNB 水解生成1 μmol 對(duì)硝基酚的酶量為一個(gè)酶活單位(U)：

式中,△OD為1 min 內(nèi)吸光值度的變化；Ⅴ為反應(yīng)液體積,mL；ε 為消光摩爾系數(shù)6 830 L·mol-1·cm-1,pH 值7.0；Ⅴ1為反應(yīng)液中酶液體積；b 為比色皿光程,cm；T 為反應(yīng)時(shí)間,min。

1.3.5 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定 最適反應(yīng)溫度的選擇：取培養(yǎng)第3 天的粗酶液10 mL,在1.3.4 的基礎(chǔ)上,將水浴溫度分別設(shè)置為25、35、45、55、65℃,水浴2 min 測(cè)定不同水浴溫度下的粗酶活性,并依據(jù)粗酶活性判斷灰葡萄孢霉角質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度。

熱穩(wěn)定性測(cè)定：取培養(yǎng)第3 天的粗酶液10 mL,在1.3.4 的基礎(chǔ)上,將水浴溫度分別設(shè)置為25、35、45、55、65℃,于不同水浴溫度下每隔2 h 測(cè)定粗酶活性,進(jìn)而判斷不同反應(yīng)溫度下粗酶的穩(wěn)定性。

1.3.6 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適反應(yīng)pH 值及pH穩(wěn)定性測(cè)定 最適反應(yīng)pH 值的選擇：取培養(yǎng)第3 天的粗酶液10 mL,在1.3.4 的基礎(chǔ)上,將磷酸緩沖液pH 值分別設(shè)置為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,測(cè)定不同pH 值磷酸緩沖液下的粗酶活性,并依據(jù)粗酶活性判斷灰葡萄孢霉角質(zhì)酶最適pH 值。

pH 值穩(wěn)定性測(cè)定：取培養(yǎng)第3 天的粗酶液10 mL,在1.3.4 的基礎(chǔ)上,將粗酶液按1∶9 的比例與不同pH 值(6～9.0)的緩沖液稀釋混勻,并于25℃水浴條件下每隔2 h 測(cè)定粗酶活性,進(jìn)而判斷不同pH 值下粗酶的穩(wěn)定性[11]。

1.3.7 金屬離子、有機(jī)溶劑對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活力的影響 在5 mL 粗酶樣品中分別加入金屬離子(Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋和Fe3＋),調(diào)節(jié)金屬離子和EDTA 終濃度為10 mmol·L-1,于4℃條件下放置1 h,按照1.3.4 所述方法測(cè)定粗酶活性。以加入等量蒸餾水的粗酶液作為對(duì)照,設(shè)定對(duì)照酶活為100%[12]。

分別向5 mL 粗酶樣液中加入0.56 mL 丙酮、甲醇、異丙醇、乙醇、乙腈和三氯甲烷,使有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)均為10%[13],于4℃放置1 h,按照1.3.4 所述方法測(cè)定粗酶活性。以加入等量蒸餾水的粗酶液為對(duì)照組,設(shè)定對(duì)照組酶活為100%。

1.3.8 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶對(duì)葡萄角質(zhì)層的影響

挑選外表皮蠟質(zhì)保持完好的葡萄果實(shí),將10 mL 粗酶液均勻噴灑于果實(shí)表面,以噴灑高溫煮沸失活的粗酶液為對(duì)照,每組處理10 個(gè)葡萄果實(shí)。處理后的葡萄果實(shí)置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,然后在葡萄赤道附近切取面積厚約1 mm 的果皮置于載玻片,并于-80℃超低溫冰箱冷凍后真空冷凍干燥24 h。干燥的樣品用離子衍射儀鍍金,厚度約20 nm,鍍金結(jié)束后進(jìn)行掃描電鏡觀察拍照[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理,應(yīng)用Origin 8.5 軟件繪制圖形,并以SAS 9.2軟件采用Duncan’s 和LSD 多重比較對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P＜0.05)。所有試驗(yàn)均設(shè)3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性的影響

由圖1可知,培養(yǎng)3 d 時(shí)角質(zhì)酶粗酶相對(duì)酶活最高,第4 天時(shí)顯著下降(P＜0.05),第4 天時(shí)角質(zhì)酶活僅為最高角質(zhì)酶活的16.41%。這可能與培養(yǎng)液中的碳源有關(guān),本試驗(yàn)以角質(zhì)為唯一碳源,灰葡萄孢霉分泌角質(zhì)酶降解角質(zhì)以獲取營(yíng)養(yǎng),隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),角質(zhì)逐漸消耗,在第4 天角質(zhì)酶活開始下降。因此本試驗(yàn)選取培養(yǎng)后第3 天作為酶活測(cè)定的時(shí)間點(diǎn)。

2.2 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適溫度及熱穩(wěn)定性

由圖2-A可知,水浴溫度為35℃時(shí)角質(zhì)酶粗酶相對(duì)酶活最高,顯著高于25、45、55℃時(shí)的相對(duì)酶活(P＜0.05)；當(dāng)水浴溫度在為25℃時(shí),其相對(duì)酶活僅為35℃時(shí)相對(duì)酶活的29.59%；45℃與55℃水浴處理組無顯著差異(P＞0.05),分別為最高酶活的75.12%與70.93%。粗酶在55℃時(shí)仍保留60%以上的酶活,表明灰葡萄孢霉粗酶中的角質(zhì)酶具有較好的耐熱性。

由圖2-B可知,在不同時(shí)長(zhǎng)的水浴條件下,角質(zhì)酶在25℃和35℃條件下較穩(wěn)定,水浴第8 小時(shí),其相對(duì)酶活依然保持90%以上；水浴溫度高于45℃時(shí),隨著溫度的升高,酶的熱穩(wěn)定性逐漸降低,經(jīng)8 h 水浴,水浴溫度為45℃時(shí)殘余酶活為83.18%,55℃時(shí)為70.0%,65℃時(shí)為59.1%,仍保持50%以上酶活。表明角質(zhì)酶粗酶熱耐受性較好,屬于中度耐熱型酶。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性的影響Fig.1 Effect of culture time on the activity of crude cutinase from Botrytis cinerea

2.3 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適pH 值與pH 值穩(wěn)定性

pH 值也是影響角質(zhì)酶活的重要因素之一。由圖3-A可知,角質(zhì)酶粗酶酶活受反應(yīng)體系pH 值的影響較大,其最適pH 值為7.5,偏堿性環(huán)境各組(pH 值在8.0～9.0 之間)間無顯著差異(P＞0.05)。當(dāng)反應(yīng)體系pH 值為9.0 時(shí),其相對(duì)酶活為72.65%。偏酸性環(huán)境各組間也無顯著差異(P＞0.05),當(dāng)反應(yīng)體系pH 值為6.0 時(shí),其相對(duì)酶活僅為43.12%。表明,角質(zhì)酶在偏堿性環(huán)境中相對(duì)酶活較高,在pH 值低于7.5 時(shí)酶活顯著下降(P＜0.05)。

圖2 溫度對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性(A)及熱穩(wěn)定性(B)的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity(A)and stability(B)of crude cutinase from Botrytis cinerea

由圖3-B可知,角質(zhì)酶在pH 值為7.5 的體系中酶活較穩(wěn)定,經(jīng)8 h 水浴,其殘余酶活仍為102.14%。；在pH 值為6.0 時(shí),酶活最不穩(wěn)定,2 h 后酶活急劇下降,至8 h 僅為初始酶活的35.02%。當(dāng)pH 值大于7.5時(shí),隨著pH 值的升高,角質(zhì)酶穩(wěn)定性逐漸下降；當(dāng)pH值小于7.5 時(shí),隨著pH 值下降,角質(zhì)酶在酸性體系中穩(wěn)定性變差。

圖3 pH 值對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性(A)及pH 值穩(wěn)定性(B)的影響Fig.3 Effect of pH value on the activity(A)and stability(B)of crude cutinase from Botrytis cinerea

2.4 金屬離子和有機(jī)溶劑對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性的影響

由圖4-A可知,Na＋、Mg2＋、Ca2＋對(duì)角質(zhì)酶粗酶酶活具有顯著促進(jìn)作用(P＜0.05),其中Na＋的作用最顯著,達(dá)到127.08%。Zn2＋、Cu2＋、Fe3＋對(duì)角質(zhì)酶粗酶酶活具有顯著抑制作用(P＜0.05),尤其是Fe3＋,僅保留52.02%的殘余酶活,Zn2＋保留70.72%的殘余酶活,Cu2＋保留79.17%的殘余酶活。

由圖4-B可知,有機(jī)溶劑中甲醇對(duì)角質(zhì)酶粗酶酶活有顯著促進(jìn)作用(P＜0.05),相比對(duì)照組提高了18.11 個(gè)百分點(diǎn),丙酮與異丙醇具有促進(jìn)作用(P＜0.05),酶活提高5.46 個(gè)百分點(diǎn)。而乙醇、乙腈與三氯甲烷有顯著抑制作用(P＜0.05),其中乙醇處理后酶活降低了34.95 個(gè)百分點(diǎn),乙腈處理后酶活降低了27.75 個(gè)百分點(diǎn),三氯甲烷處理后酶活降低了36.18個(gè)百分點(diǎn)。角質(zhì)酶在有機(jī)溶劑中酶活不同可能是由于二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應(yīng)的變化[15]。

圖4 金屬離子(A)和有機(jī)溶劑(B)對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶活性的影響Fig.4 Effect of metal ions(A)and organic solvent(B)on activity of crude cutinase from Botrytis cinerea

2.5 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶對(duì)葡萄角質(zhì)層的降解

由圖5-A可知,噴灑失活角質(zhì)酶粗酶的葡萄角質(zhì)層結(jié)構(gòu)致密,分布均勻以鱗片形式存在,表皮蠟質(zhì)無明顯降解。而未失活粗酶處理后,表皮蠟質(zhì)出現(xiàn)明顯降解,出現(xiàn)降解部分與正常部分分界線(圖5-B)。正常部分蠟質(zhì)完好,均勻致密,而降解部分出現(xiàn)類似于蠟質(zhì)溶解的現(xiàn)象,蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,與完好蠟質(zhì)差異明顯。角質(zhì)層作為保護(hù)果實(shí)的第一道屏障,當(dāng)表皮蠟質(zhì)降解后,這道保護(hù)層遭到破壞,使角質(zhì)層內(nèi)層暴露在外,更易受到病原菌侵染。

圖5 灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶對(duì)葡萄角質(zhì)層的影響Fig.5 Effect of crude cutinase from Botrytis cinerea on grape’s cuticle

3 討論

灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶的最適反應(yīng)溫度為35℃,大多數(shù)真菌角質(zhì)酶的最適溫度為30～40℃,這與本研究結(jié)果基本一致。細(xì)菌角質(zhì)酶比真菌角質(zhì)酶更耐熱,如嗜熱細(xì)菌Thermobifi da fusca角質(zhì)酶最適溫度為60℃[16],大多數(shù)細(xì)菌角質(zhì)酶最適溫度為 40～60℃[17-18]。水果采后通常在高溫的夏季,為角質(zhì)酶提供了適宜的溫度,使果實(shí)更易受到灰葡萄孢霉的侵染,因此采后應(yīng)盡快進(jìn)行預(yù)冷處理,一方面有助于消除田間熱,另一方面能夠抑制角質(zhì)酶活性,減少灰霉病害。除最適溫度外,酶的熱穩(wěn)定性也受溫度的影響。本研究表明,灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶在35～55℃穩(wěn)定性良好,孵育8 h 后在55℃條件下酶活仍能達(dá)到70.0%,說明此角質(zhì)酶具有較強(qiáng)熱穩(wěn)定性。有研究報(bào)道畫眉草彎孢霉的角質(zhì)酶在40℃孵育20 min,酶活可下降50%[9],與本研究結(jié)果不一致可能與菌株不同有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)NRRL B-16117 角質(zhì)酶在50～60℃條件下可保持高度穩(wěn)定性[19],真菌Fusarium solani pisi角質(zhì)酶在60℃條件下水浴5 min 后即喪失50%酶活[20],說明角質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性受菌種來源的影響。

最適pH 值與pH 值穩(wěn)定性是酶蛋白的重要性質(zhì),最適pH 值不是一個(gè)特征常數(shù),隨底物種類、濃度、溫度及緩沖液成分變化而變化。本研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶的最適pH 值為7.5,符合大部分角質(zhì)酶最適pH 值為6.0～10.0[17,20],畫眉草彎孢霉角質(zhì)酶最適pH 值為7.5[9]?；移咸焰呙菇琴|(zhì)酶在pH 值為7.5 時(shí)穩(wěn)定性較高,且偏堿性環(huán)境中酶的pH 穩(wěn)定性比偏酸條件下更高。煙草赤星病菌在pH 值為5.0～9.0 時(shí)酶活較穩(wěn)定,在35℃條件下孵育1 h 后,在pH 值為9.0的體系中穩(wěn)定性較高[21],這種差異也可能與菌種不同有關(guān)。

金屬離子也會(huì)影響酶的活性[22]。Na＋、Mg2＋、Ca2＋對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶的酶活有促進(jìn)作用,Zn2＋、Cu2＋、Fe3＋抑制粗酶活性,這與L3-2 胞外酯酶粗酶[14]、重組Thermobifida fusca角質(zhì)酶[23]的相關(guān)研究結(jié)果基本一致。Mg2＋、Ca2＋對(duì)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶具有輕微促進(jìn)作用,Mg2＋對(duì)膠紅酵母角質(zhì)酶酶活具有激活作用[24],這是因?yàn)楦邼舛冉饘匐x子與角質(zhì)酶表面相關(guān)基團(tuán)作用,改變酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)10%乙醇處理能夠明顯降低角質(zhì)酶活性,王莉[15]發(fā)現(xiàn)在37℃時(shí),角質(zhì)酶在20%～50%乙醇中具有較好的穩(wěn)定性,可能是由于角質(zhì)酶在不同體系中酶的構(gòu)象不同,導(dǎo)致其活性不同。黃曉杰[26]發(fā)現(xiàn)采后乙醇處理能有效抑制藍(lán)莓果實(shí)貯藏期間腐爛指數(shù)的上升,可能是由于乙醇處理在一定程度上抑制了灰葡萄孢霉角質(zhì)酶活性。因此乙醇處理在葡萄采后保鮮應(yīng)用中具有良好的應(yīng)用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶對(duì)葡萄角質(zhì)層蠟質(zhì)具有明顯的降解作用。Schweizer 等[27]研究發(fā)現(xiàn)真菌病原體禾白粉菌(Erysiphe graminisf.sp.hordei)能夠降解大麥角質(zhì)層,釋放角質(zhì)單體,也驗(yàn)證了游離角質(zhì)單體能夠激活植物防御反應(yīng)。目前,關(guān)于葡萄角質(zhì)層降解后產(chǎn)物尚不明確,其蠟質(zhì)或角質(zhì)降解產(chǎn)物是否具有誘導(dǎo)抗病性的作用還有待進(jìn)一步研究。也有研究表明植物蠟質(zhì)在逆境脅迫下,相關(guān)合成基因表達(dá)會(huì)發(fā)生變化,以抵御外界環(huán)境的侵害[28]。后續(xù)可利用分子生物學(xué)技術(shù)繼續(xù)探究葡萄角質(zhì)層被灰葡萄孢霉降解后蠟質(zhì)和角質(zhì)相關(guān)基因的變化。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶最適反應(yīng)溫度為35℃,最適反應(yīng)pH 值為7.5,具有良好的耐熱性與耐堿性,金屬離子Zn2＋、Cu2＋、Fe3＋,有機(jī)溶劑乙醇對(duì)酶活具有抑制作用,同時(shí)角質(zhì)酶粗酶對(duì)葡萄角質(zhì)層具有降解作用。為灰葡萄孢霉角質(zhì)酶粗酶酶活抑制因子的發(fā)現(xiàn)及果實(shí)采前處理或采后貯藏技術(shù)提供了一定的理論基礎(chǔ),同時(shí)為角質(zhì)酶對(duì)植物角質(zhì)層的降解作用提供了參考。角質(zhì)酶與葡萄角質(zhì)層之間的相互作用以及降解產(chǎn)物對(duì)葡萄抗病性的影響還有待進(jìn)一步研究。