王金才　于鴿　劉喚明　鄧楚津　洪鵬志　湯寶貴

摘要 [目的]對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中紅酵母進(jìn)行篩選，并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行研究。[方法]首先利用PDA固體培養(yǎng)基從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中篩選出紅酵母菌株HL-6;然后，根據(jù)26S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，對(duì)菌株HL-6 進(jìn)行鑒定;最后，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]經(jīng)初步鑒定確定菌株HL-6為膠紅酵母，該菌株的最佳發(fā)酵工藝如下：糖蜜濃度為8%，酵母膏濃度為1.5%，硫酸銨濃度0.6%，磷酸二氫鉀濃度為0.3%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為48 h。在此工藝條件下，發(fā)酵液中紅酵母的活菌數(shù)高達(dá)11.2×108 CFU/mL。[結(jié)論]該研究對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖所用紅酵母的發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞 對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境;紅酵母;篩選;發(fā)酵工藝

中圖分類號(hào) S917.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2020）11-0104-03

Abstract [Objective]To ?screen out Rhodotorula ?sp. ?in ?culture environment of shrimp， and study its fermentation technology. [Method] Firstly， Rhodotorula ?sp. strain HL6 was screened out from culture environment of shrimp by using PDA solid medium. Secondly， the strain HL6 was identified based on phylogenetic tree analysis of 26S rDNA gene sequence. Finally， the fermentation technology was optimized by orthogonal experiment on the basis of single factor experiment. [Result] The strain HL6 was preliminarily identified as Rhodotorula mucilaginosa. The optimum fermentation conditions of the strain were as follow： molasses 8%， yeast extract 1.5%， ammonium sulfate 0.6%， potassium dihydrogen phosphate concentration 0.3%， fermentation temperature 30 ℃ and fermentation time 48 h. Under the above conditions， the ?number ?of Rhodotorula ?sp. in the fermentation broth was as high as 11.2×108 CFU/mL. [Conclusion] The study had certain reference values for the fermentation production of ?Rhodotorula sp. used in shrimp culture.

Key words Shrimp culture environment;Rhodotorula sp.;Screening;Fermentation technology

紅酵母是一類抗逆性較強(qiáng)的腐生菌，廣泛分布于海洋、淡水等環(huán)境中。紅酵母具有優(yōu)良的脂肪酸組成、豐富的必需氨基酸[1]，且還富含以蝦青素為主的類胡蘿卜素[2]，顯示其在飼料和養(yǎng)殖領(lǐng)域具有很好的潛在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。陳昌福等[3]研究表明在餌料中添加海洋1號(hào)紅酵母可以提高日本對(duì)蝦幼蝦的成活率，促進(jìn)生長(zhǎng)，增加對(duì)環(huán)境因子的耐受力。薛德林等[4]研究表明往養(yǎng)殖水體中添加海洋膠紅酵母能降低海參的發(fā)病率，提高海參的產(chǎn)量。另有研究表明，在水產(chǎn)飼料中添加紅酵母可以提高水產(chǎn)動(dòng)物消化酶的活性，改善腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)[5-6]。由此可見，紅酵母在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有良好的應(yīng)用前景。

雖然紅酵母在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有良好的應(yīng)用前景，但目前市場(chǎng)上還缺乏對(duì)蝦養(yǎng)殖用的紅酵母菌劑。目前國(guó)內(nèi)已有人從斑馬魚腸道[7]、海參腸道[8]和紅色淤泥[9]等環(huán)境篩選出紅酵母，但從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中篩選出紅酵母卻鮮有報(bào)道，且從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中篩選的土著紅酵母應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖有更好的適應(yīng)性。筆者從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境篩選出紅酵母，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為紅酵母應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。菌株篩選樣品為對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的海水和底泥。

1.1.2 培養(yǎng)基。PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、 葡萄糖20 g、瓊脂20 g、氯霉素0.2 g、 蒸餾水1 000 mL，115 ℃下滅菌20 min，備用。

1.1.3 試驗(yàn)儀器。LS-B50L 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，由上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司生產(chǎn);SW-CJ-2F 型潔凈工作臺(tái)，由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱，由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);HZQ-F160型恒溫?fù)u床，為金壇市萬華實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品;L1100A型生物顯微鏡，為廣州粵顯光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;722s型可見分光光度計(jì)，為上海第三分析儀器廠產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅酵母的篩選。取樣品10 g 加入到90 mL 無菌水中，梯度稀釋，選取其中3個(gè)梯度的稀釋液涂布到PDA固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h;挑選顏色為紅色的菌落在PDA固體平板上劃線培養(yǎng)，然后選取紅色的單菌落轉(zhuǎn)接到試管斜面PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 ℃下培養(yǎng)48 h。然后，利用顯微鏡觀察斜面中培養(yǎng)的微生物，選取個(gè)體形態(tài)較大、形狀為圓形或橢圓形的菌株作為疑似紅酵母的菌株進(jìn)行下一步鑒定。

1.2.2

紅酵母的鑒定。采用孫建男等[10]的方法，對(duì)疑似菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域的序列進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增成功后的PCR產(chǎn)物送至上海生工公司測(cè)序，測(cè)序后得到的結(jié)果提交GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 比對(duì)，再進(jìn)行同源性分析，最后使用MEGA5.0 軟件進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.3 酵母菌生長(zhǎng)情況的測(cè)定方法。①比濁法。用滅菌后未接種前的培養(yǎng)基調(diào)零，使用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定培養(yǎng)好的酵母菌發(fā)酵液的吸光值。②平板計(jì)數(shù)法。酵母菌的計(jì)數(shù)使用PDA固體培養(yǎng)基，將需要計(jì)數(shù)的樣品進(jìn)行梯度稀釋后，涂布于PDA培養(yǎng)基，30 ℃下培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)30～300的平板計(jì)數(shù)，1個(gè)稀釋度選擇2個(gè)平板。

1.2.4 單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝。 ?①糖蜜濃度的優(yōu)化。分別選取5%、6%、7%、8%和9%的糖蜜濃度作為碳源，置于30 ℃恒溫?fù)u床中，120 r/min培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液的吸光值。②酵母膏濃度的優(yōu)化。糖蜜濃度為7%，酵母膏的濃度分別為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%，置于30 ℃恒溫?fù)u床中，120 r/min培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液的吸光值。③硫酸銨濃度的優(yōu)化。糖蜜濃度為7%，酵母膏濃度為0.9%，硫酸銨的濃度分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%，于30 ℃恒溫?fù)u床中，120 r/min培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液的吸光值。④磷酸二氫鉀濃度的優(yōu)化。糖蜜濃度為7%，酵母膏濃度為0.9%，硫酸銨濃度為0.6%，磷酸二氫鉀的濃度分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，置于30 ℃恒溫?fù)u床中，120 r/min培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液的吸光值。⑤發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化。糖蜜濃度為7%，酵母膏濃度為0.9%，硫酸銨0.6%，磷酸二氫鉀的濃度為0.3%，置于30 ℃恒溫?fù)u床中，120 r/min下分別培養(yǎng)36、42、48、54和60 h，測(cè)定發(fā)酵液的吸光值。

1.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取糖蜜濃度、酵母膏濃度、硫酸銨濃度和磷酸二氫鉀濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅酵母的篩選

從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的海水和底泥中篩選出1株紅酵母菌株HL-6，對(duì)篩選出的酵母菌株進(jìn)行平板

菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察，結(jié)果如圖1所示。菌株HL-6的

菌落形態(tài)特征如下：菌落呈橘紅色，邊緣整齊，圓形，隆起，表面濕潤(rùn)，易挑起。菌株菌株M5的菌體形態(tài)特征如下：菌體呈橢圓形，可進(jìn)行出芽生殖。

2.2 紅酵母的鑒定

將菌株HL-6的測(cè)序結(jié)果，通過GenBank 數(shù)據(jù)庫中已收錄的酵母26S rDNA D1/D2 區(qū)序列比對(duì)，HL-6與Rhodotorula mucilaginosa CBS 316的相似性最高，高達(dá)100%。選取序列相似度高 的部分菌種，采用軟件MEGA5.0 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，HL-6與Rhodotorula mucilaginosa CBS 316處于同一分支上，親緣關(guān)系最近。綜合以上分析，可初步鑒定HL-6為膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。

2.3 紅酵母發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.3.1 糖蜜濃度對(duì)紅酵母生長(zhǎng)的影響。

由圖3可知，隨著糖蜜濃度的增加，紅酵母發(fā)酵液的吸光值先增加后減少。當(dāng)糖蜜濃度為7%時(shí)，發(fā)酵液吸光值最高。

2.3.2 酵母膏濃度對(duì)紅酵母生長(zhǎng)的影響。

由圖4可知，隨著酵母膏濃度的增加，發(fā)酵液的吸光值先增加后減少。當(dāng)酵母膏濃度為0.9%時(shí)，發(fā)酵液吸光值最高。

2.3.3 硫酸銨濃度對(duì)紅酵母生長(zhǎng)的影響。

由圖5可知，添加無機(jī)氮源硫酸銨可使發(fā)酵液的吸光值增加，隨著硫酸銨濃度的增加，發(fā)酵液的吸光值先增加后減少。當(dāng)硫酸銨濃度為0.6%時(shí)，發(fā)酵液吸光值最高。

2.3.4 磷酸二氫鉀濃度對(duì)紅酵母生長(zhǎng)的影響。

由圖6可知，添加磷酸二氫鉀可使發(fā)酵液的吸光值增加，隨著磷酸二氫鉀濃度的增加，發(fā)酵液的吸光值先增加后減少。當(dāng)磷酸二氫鉀濃度為0.3%時(shí)，發(fā)酵液吸光值最高。

2.3.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅酵母生長(zhǎng)的影響。

由圖7可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于48 h時(shí)，發(fā)酵液吸光值不斷下降，因此最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見表2。由表2 可知，各因素的最優(yōu)水平為A3B3C2D1，即糖蜜濃度為8%，酵母膏濃度為1.5%，硫酸銨濃度為0.6%，磷酸二氫鉀濃度為0.3%。在以上條件下，發(fā)酵液的吸光值為1.889，經(jīng)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定該發(fā)酵液的活菌數(shù)為11.2×108 CFU/mL。 從R值的大小可以看出，酵母膏濃度的影響最大，其次為糖蜜濃度，而磷酸二氫鉀濃度的影響最小。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的海水和底泥篩選出的紅酵母HL-6作為菌種，利用26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析的方法初步鑒定紅酵母HL-6為膠紅酵母，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定了膠紅酵母HL-6 的最佳發(fā)酵工藝：糖蜜濃度為8%，酵母膏濃度為1.5%，硫酸銨濃度為0.6%，磷酸二氫鉀濃度為0.3%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為48 h。在以上工藝條件下，發(fā)酵液的活菌數(shù)達(dá)11.2×108 CFU/mL。該研究對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖用的紅酵母的發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。

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