徐清萍，劉楊，胡麗亞，唐百芬，柳東燕

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450001)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等細(xì)菌是引起食源性疾病的主要病原菌[1,2]。細(xì)菌污染食品后不但降低了食品的品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值，還會產(chǎn)生一些令人難以接受的感官性狀和毒素。為了抑制因微生物活動引起的食品腐敗變質(zhì)，通常采用添加防腐劑的方式。苯甲酸鈉、亞硝酸鹽等是常用的傳統(tǒng)防腐劑，具有潛在的致癌性、致畸性、環(huán)保問題等，因此人們對防腐劑類的食品添加劑在安全性能上提出了更高的要求。乳酸菌是世界公認(rèn)的食品級安全微生物，其發(fā)酵代謝產(chǎn)物可作為食品防腐劑和抗生素替代物來抑制大量致病菌和真菌的生長。乳酸菌能發(fā)酵葡萄糖或乳糖產(chǎn)生乳酸，具有調(diào)節(jié)人體機(jī)能、延緩衰老、預(yù)防疾病等作用，主要用于制造酸奶、奶酪、泡菜、酸菜、其他發(fā)酵食品以及一些保健品[3-5]。乳酸菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的各種產(chǎn)物對乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)、風(fēng)味和感官特性具有重要的影響[6]。乳酸菌代謝產(chǎn)生的多種物質(zhì)還具有抑菌作用，主要包括乳酸、乙酸、檸檬酸等有機(jī)酸，CO2、H2O2、胞外多糖、細(xì)菌素及其他活性成分[7]。乳酸菌代謝產(chǎn)生的苯乳酸可以有效抑制革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌和真菌的生長[8]。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusLS-8)能產(chǎn)生一種新的小分子抑菌物質(zhì) 4,6-二甲基-1,2,5-三嗪-3,7-二酮(C6H11N3O2)，該物質(zhì)僅在酸性條件下具有抑菌活性，可抑制常見的革蘭氏陽性和陰性的食源性致病菌。植物乳桿菌(LactobacillusplantarumEM)產(chǎn)生的3-羥基-5-十二碳烯酸(3-hydroxy-5-dodecenoic acid MW 214)對蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)和煙曲霉(A.fumigatus)有殺菌作用[10]，3-羥基-5-十二碳烯酸和乳酸、乙酸等活性化合物聯(lián)合使用時(shí)能增強(qiáng)抗菌作用。

辣椒、生姜、花椒等香辛料常用于泡菜等食品加工中，具有賦予風(fēng)味、增進(jìn)食欲等作用，在泡菜等食品生產(chǎn)中添加香辛料不僅能起到改善風(fēng)味的作用，還對其中的雜菌具有抑制效果。辣椒、大蒜、花椒、生姜對四川低鹽泡菜發(fā)酵過程中酵母菌、芽孢菌的生長均具有不同程度的抑制作用[11]?；ń?、辣椒、生姜和大蒜的乙醇提取物對馬鈴薯干腐病菌、番茄灰霉病菌、尖孢鐮刀病菌、蘋果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌和蘋果腐爛病菌等真菌具有抑制作用[12]。不同香辛料提取物對不同細(xì)菌的抑菌效果不一，八角、丁香、肉桂等香辛料的提取物在濃度50 mg/mL時(shí)對金黃色葡萄球菌、假單胞菌等的抑菌效果較好[13]。香辛料中的抑菌成分主要與從香辛料中提取的精油相關(guān)，酚類物質(zhì)是香辛料精油抑菌的主要活性成分[14]。

乳酸菌是泡菜發(fā)酵的常見菌株，在發(fā)酵泡菜的過程中，對香辛料等原料成分可能具有修飾活性成分結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生新的活性物質(zhì)等作用。研究不同香辛料對乳酸菌發(fā)酵的影響，有利于明確香辛料在生產(chǎn)過程中對乳酸菌的生長及抑菌活性的影響，對于泡菜生產(chǎn)中香辛料的選擇以及添加比例的確定具有一定的指導(dǎo)意義。通過優(yōu)化香辛料及乳酸菌組合，對抑制發(fā)酵過程中雜菌的生長、延長保質(zhì)期具有積極意義。

本文主要選擇了11種常見香辛料，并對不同香辛料添加對發(fā)酵過程中嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌生長及抑菌性能的影響進(jìn)行了研究，以便于為泡菜、醬腌菜等行業(yè)科學(xué)合理使用香辛料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL、大腸桿菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895：由鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品新產(chǎn)品新技術(shù)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供；金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003：上海魯微科技有限公司；牛津杯(φ7.8 mm)；白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、八角、香葉、芫荽子、辣椒：市售；MRS瓊脂、MRS肉湯、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯：購自杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

TGL-16C型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器制造廠；721型可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；宏諾牌VD-650型凈化工作臺；3C3A-3型電熱培養(yǎng)箱、202-0A型電熱恒溫干燥箱 滬南電爐烘箱廠；電子數(shù)顯卡尺。

1.3 香辛料提取液的制備

分別稱取白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、八角、香葉、芫荽子、辣椒10 g，粉碎，按料液比1∶15加水，煮沸30 min，過濾，分離濾液。將料渣中加水煮沸二次提取，合并兩次濾液蒸發(fā)濃縮至10 mL，10000 r/min離心10 min。取出上清液，加水定容至10 mL，濃度為1 g/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 香辛料對乳酸菌生長的影響

將嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL分別采用MRS斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接入MRS肉湯培養(yǎng)基，32 ℃培養(yǎng)18 h，備用。配制含香辛料濃度為20 mg/L的MRS肉湯培養(yǎng)基，按1%接種量接入活化好的乳酸菌種液，32 ℃培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后取5 mL培養(yǎng)液于無菌離心管中，12000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入0.9%的無菌生理鹽水進(jìn)行清洗沉淀，并用5 mL無菌生理鹽水震蕩均勻制成菌懸液，適當(dāng)稀釋菌懸液后，測定菌懸液在600 nm處的吸光度。以直接采用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的乳酸菌為對照，嗜酸乳桿菌LA按照標(biāo)準(zhǔn)曲線N0=14.845A-0.8323，R2=0.9951，乳酸乳球菌按照標(biāo)準(zhǔn)曲線N0=18.248A+3.3125，R2=0.9975計(jì)算菌懸液中的菌數(shù)。其中，A為乳酸菌菌懸液在600 nm處的吸光度，N0為乳酸菌菌懸液中的乳酸菌數(shù)。發(fā)酵液中乳酸菌菌數(shù)=稀釋倍數(shù)×N0×106CFU/mL。

1.5 抑菌圈直徑的測定

將大腸桿菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003分別于37 ℃活化，接入肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，離心，用生理鹽水洗滌，并將菌濃度調(diào)整到106CFU/mL，備用。

配制雙層平板，將15 mL瓊脂(2%)培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，靜置，凝固，作為下層。將冷卻至50 ℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基5 mL倒入已經(jīng)凝固的下層平板上，作為上層。取0.2 mL大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌懸液涂布平板，涂布均勻。將滅菌牛津杯(φ7.8 mm)均勻放置在培養(yǎng)基上，使其與培養(yǎng)基無縫隙。取200 μL待測液于牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察抑菌情況，采用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。無抑菌圈為不敏感，抑菌圈直徑<10 mm為輕度敏感, 在10～14 mm之間為中度敏感，在15～20 mm之間為高度敏感，>20 mm為極度敏感[15,16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同香辛料添加對乳酸菌生長的影響

選取白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、八角、香葉、芫荽子、辣椒這11種香辛料，按照20 g/L添加到MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別接種嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL，培養(yǎng)24 h后，采用分光光度法測定乳酸菌數(shù)。以未加香辛料的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌菌數(shù)為對照，考察不同香辛料對乳酸菌生長的影響。其中，總菌數(shù)變化率=(香辛料組總菌數(shù)-對照組總菌數(shù))/對照組總菌數(shù)×100%。

11種香辛料對嗜酸乳桿菌LA生長的影響見圖1，其中圖1中(1)為添加不同香辛料發(fā)酵24 h后總菌數(shù)(分光光度法)，圖1中(2)為以采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后總菌數(shù)為對照，添加不同香辛料發(fā)酵24 h后總菌數(shù)的變化率。

(1)

(2)

由圖1可知，添加量為20 g/L時(shí)，多數(shù)香辛料的添加對嗜酸乳桿菌LA的增殖有一定的抑制作用，其中丁香對嗜酸乳桿菌LA的增殖抑制作用最明顯，與對照組相比，總菌數(shù)減少23.3%；其次為香葉、辣椒、生姜。肉桂的添加對嗜酸乳桿菌LA的生長具有一定的促進(jìn)作用。白芷、高良姜、白胡椒、花椒、八角、芫荽子對嗜酸乳桿菌LA的生長影響相對較小，菌數(shù)變化在±5%以內(nèi)。

11種香辛料對乳酸乳球菌LL生長的影響見圖2，其中圖2中(1)為添加不同香辛料發(fā)酵24 h后總菌數(shù)(分光光度法)，圖2中(2)為以采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后總菌數(shù)為對照，添加不同香辛料發(fā)酵24 h后總菌數(shù)的變化率。

(1)

(2)

由圖2可知，添加量為20 g/L時(shí)，多數(shù)香辛料的添加對乳酸乳球菌LL的增殖有一定的抑制作用，其中八角對乳酸乳球菌LL的增殖抑制作用最明顯，與對照組相比，總菌數(shù)減少9.5%；其次為辣椒。白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、香葉、芫荽子對乳酸乳球菌LL的生長影響相對較小，菌數(shù)變化在±4%以內(nèi)。

由圖1和圖2可知，不同香辛料對不同乳酸菌生長的影響存在著一定的差異，對于白芷、高良姜、白胡椒、花椒、芫荽子這些常見香辛料來說，在一定濃度范圍內(nèi)，香辛料對乳酸菌的增殖影響不大。

2.2 不同香辛料添加對乳酸菌發(fā)酵液抗菌性的影響

抑菌圈實(shí)驗(yàn)通常用來作為抗菌劑抑菌活性的篩選，其中抑菌圈直徑大于20 mm，極敏感；15～20 mm，高敏感；10～15 mm，中敏感；7～10 mm，不敏感。將香辛料提取液以20 mg/mL添加到MRS液體培養(yǎng)基中，混合均勻，嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL均按1%接種量接種發(fā)酵，32 ℃發(fā)酵24 h后，測定11種香辛料發(fā)酵上清液的抑菌活性，結(jié)果見圖3和圖4。

2.2.1 香辛料對嗜酸乳桿菌發(fā)酵液抑菌性的影響

嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液及添加不同香辛料時(shí)嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液對大腸桿菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895和金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌性見圖3。

(1)

(2)

其中，抑菌活性改變率C(%)=(D香辛料-D對照)/D對照×100%，D香辛料表示添加香辛料時(shí)乳酸菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑，D對照表示未添加香辛料，采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌時(shí)的抑菌圈直徑。由圖3中(1)可知，嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌具有抑菌性，不同香辛料的添加對其抑菌活性有一定的影響。由圖3中(2)可知，添加高良姜時(shí)有利于提高嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌性，其次為生姜。添加辣椒時(shí)有利于提高嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌性，其次為芫荽子、白芷、高良姜、香葉。添加丁香組，嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌活性明顯降低，應(yīng)該與丁香對嗜酸乳桿菌的生長有明顯抑制作用相關(guān)。對比不同香辛料對嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液抑菌性的影響，高良姜有利于提高嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性。同時(shí)對同濃度香辛料液的抑菌性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明同濃度的香辛料液對大腸桿菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003無抑菌性。表明添加香辛料后抑菌活性通過促進(jìn)發(fā)酵或轉(zhuǎn)化得以提高。將嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液的pH調(diào)整至7時(shí)，測定抑菌活性，則無明顯抑菌圈，表明抑菌活性成分主要為有機(jī)酸或主要在酸性條件下起抑菌作用。`

2.2.2 不同香辛料對乳酸乳球菌發(fā)酵液抑菌性的影響

乳酸乳球菌LL發(fā)酵液及添加不同香辛料時(shí)乳酸乳球菌LL發(fā)酵液對大腸桿菌EscherichiacoliO157:H7ATCC 43895和金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌性見圖4。

(1)

(2)

由圖4中(1)可知，乳酸乳球菌LL發(fā)酵液對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌性，不同香辛料的添加對其抑菌活性有一定的影響。由圖4中(2)可知，香葉的添加對乳酸乳球菌LL發(fā)酵液對大腸桿菌抑菌活性的提高具有促進(jìn)作用，花椒的添加有利于提高乳酸乳球菌LL對金黃色葡萄球菌的抑菌性。多數(shù)香辛料的添加會降低發(fā)酵液對大腸桿菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895和金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌性，對比香辛料對乳酸乳球菌LL生長的影響結(jié)果，除個別香辛料對乳酸乳球菌的生長影響較小外，多數(shù)香辛料對乳酸乳球菌LL的生長具有抑制作用。香辛料的添加對乳酸乳球菌LL發(fā)酵液抑菌活性的降低可能與其對乳酸乳球菌生長的抑制作用有關(guān)。將乳酸乳球菌發(fā)酵液的pH調(diào)整至7時(shí)，測定抑菌活性，則無明顯抑菌圈，表明乳酸乳球菌LL發(fā)酵液的抑菌活性成分主要受pH的影響，其抑菌作用主要在酸性條件下才能發(fā)揮。

3 結(jié)論

香辛料主要用于各種食品的調(diào)味增香等，用于泡菜、醬腌菜等行業(yè)，除辣椒、生姜等少數(shù)香辛料外，多數(shù)香辛料的添加范圍低于1%。本文對生姜、高良姜、香葉、花椒等11種常見的香辛料對嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌的生長及發(fā)酵液抑菌性的影響進(jìn)行了研究，結(jié)論如下：

不同香辛料對不同乳酸菌的生長影響存在著一定的差異。香辛料使用濃度為20 mg/mL時(shí)，丁香對嗜酸乳桿菌LA的增殖抑制作用最明顯，其次為香葉、辣椒、生姜；八角對乳酸乳球菌LL的增殖抑制作用最明顯，其次為辣椒。其余多數(shù)香辛料，白芷、高良姜、白胡椒、花椒、八角、芫荽子的添加對嗜酸乳桿菌LA的生長影響較小，白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、香葉、芫荽子對乳酸乳球菌的生長影響相對較小。

濃度為20 mg/mL時(shí)，高良姜能明顯提高嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌性，其次為生姜；辣椒能明顯提高嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌性，其次為芫荽子、白芷、高良姜、香葉。丁香則能明顯降低嗜酸乳桿菌發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌活性。

香葉的添加有利于提高乳酸乳球菌發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌活性，花椒的添加有利于提高乳酸乳球菌LL對金黃色葡萄球菌的抑菌性。白芷、高良姜、生姜等多數(shù)香辛料的添加會降低發(fā)酵液對大腸桿菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌性。

嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌發(fā)酵液對大腸桿菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌活性成分主要為有機(jī)酸或其抑菌活性在酸性條件下起作用。

通過對生姜、高良姜、辣椒、花椒等香辛料對嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL生長及抑菌性的研究，表明不同香辛料對不同乳酸菌的生長及抑菌性的影響不同。通過合理組合香辛料及乳酸菌，能更加有效地抑制雜菌，促進(jìn)安全生產(chǎn)。