邊 倩 吳昭利 程丹丹 魏海梁 閆曙光 李京濤

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院1 肝病二科，2 腫瘤一科，咸陽市 712000，電子郵箱：p234liuxue@163.com；3 陜西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院，咸陽市 712046；4 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，咸陽市 712000；5 陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，咸陽市 712046；6 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病一科，咸陽市 712000)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，具有難預(yù)防、預(yù)后差及死亡率高等特點。在我國，肝癌發(fā)病率在所有腫瘤中高居第4位，其已成為我國人群主要死因之一[1]。目前原位性肝癌的病因和發(fā)病機制仍未明確，臨床研究表明肝癌發(fā)病是環(huán)境與飲食雙重因素作用的結(jié)果，其中肝炎病毒、黃曲霉素、亞硝胺類物質(zhì)、微量元素等與肝癌的發(fā)生相關(guān)[2-4]。肝癌早期癥狀不明顯，大部分患者確診時已處于中晚期，甚至已發(fā)生其他器官的轉(zhuǎn)移，而不規(guī)范治療會縮短患者的生存期，因此開展規(guī)范治療對于患者的預(yù)后有重大意義。清肝化瘀顆粒藥性溫和，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，可以有效控制肝癌患者的病情，減輕病患的痛苦，提高患者生存質(zhì)量，且臨床用藥副作用較小[5]。肝細(xì)胞癌變與細(xì)胞內(nèi)信號通路失調(diào)相關(guān)，其中迅速加速纖維肉瘤蛋白(rapidly accelerated fibrosarcoma，Raf)/絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal regulated-kinase，MEK)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。本文探討清肝化瘀顆粒治療肝癌模型大鼠對Raf/MEK/ERK通路表達(dá)的影響，以進(jìn)一步了解清肝化瘀顆粒治療肝癌的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取無特定病原體級健康雄性Wistar大鼠50只，體重200～220 g，由遼寧長生生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2018-0015。整個實驗過程中，大鼠均飼養(yǎng)于溫度為20℃～25℃、濕度為55%的動物房。本研究通過動物倫理委員會批準(zhǔn)，符合道德倫理要求。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑：二甲苯(批號：20180724)購自上海朵生生物公司，無水乙醇(批號：20171106)和過氧化氫(批號：20161020)購自南京森貝伽生物公司；一步法快速免疫印跡試驗辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)試劑盒(兔)(批號:CW02029)、一步法快速免疫印跡試驗HRP試劑盒 (鼠) (批號:CW02030)均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑(批號：20180104)購自Solarbio公司，蘇木精染色液(批號：CS20170612)購自北京酷來博科技有限公司，TRIzol Reagent 總RNA提取試劑(批號：DP405-02)購自Invitrogen Fisher Scientific公司。清肝化瘀顆粒(批號：20170731)由中日友好醫(yī)院藥學(xué)部制劑室制備。

1.2.2 主要儀器：電泳儀(型號：DYY-6D)購自北京六一儀器廠，圖像分析軟件購自Adobe公司，實時熒光定量PCR儀(型號:ABI 7500型)購自美國ABI公司，低溫高速離心機(型號：Centrifuge 5810R)購自上海高致精密儀器有限公司，紫外分光光度計(型號NanoDrop 2000)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及肝癌模型建立[8]：實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型對照組、清肝化瘀顆粒低劑量組、清肝化瘀顆粒中劑量組和清肝化瘀顆粒高劑量組，每組10只。模型對照組和清肝化瘀顆粒各劑量組大鼠給予含2.5 g/L二乙基亞硝胺的滅菌食用水自由飲用，空白對照組大鼠給予滅菌食用水自由飲用，14周后停用，清肝化瘀顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠每天分別給予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg的清肝化瘀顆粒灌胃，空白對照組、模型對照組給予等量的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃2周。

1.3.2 肝組織形態(tài)學(xué)觀察：灌胃結(jié)束時，處死大鼠，取出各組大鼠肝臟組織5 g置于10%中性福爾馬林液中固定，石蠟包埋、切片后，部分用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3 免疫組化檢測：取各組大鼠肝組織標(biāo)本切片脫蠟后用抗原修復(fù)，在過氧化氫中孵育10～15 min，再用山羊血清封閉，加入一抗(武漢戴安生物，批號：20170816)4℃孵育過夜后37℃復(fù)溫45 min，加入二抗(武漢戴安生物，批號：20181108)37℃孵育 30 min，加入二氨基聯(lián)苯胺顯色劑覆蓋組織，蘇木精復(fù)染1 min，脫水、透明、封片。使用IIP6.0軟件測定整體A值。

1.3.4 實時熒光定量PCR：處死大鼠后，取3 g大鼠肝組織剪碎勻漿后，利用TRIzol 法提取大鼠肝組織總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海博湖生物科技有限公司，批號：CW03028)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-肌動蛋白為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實時熒光定量PCR，反應(yīng)體系為20 μL，包括10×SYBR Green PCR溶液10 μL，引物(5 pmol/L)1 μL，模板1 μL，滅菌雙蒸水8 μL。反應(yīng)條件為50℃孵育2 min，然后95℃ 2 min；40個循環(huán)，95℃，15 s；60℃，1 min。采用 2-ΔΔCt法計算Raf mRNA、MEK mRNA和ERK mRNA 相對表達(dá)量。

1.3.5 免疫印跡試驗檢測：處死大鼠后，取3 g大鼠肝組織剪碎勻漿后，加入適量RIPA裂解液裂解組織提取總蛋白，利用二喹啉甲酸試劑盒(上海佰曄生物科技中心，批號：N1683-2)檢測蛋白濃度。將所得蛋白煮沸10 min使其變性后上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h，濕法轉(zhuǎn)膜45 min。加入5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜后，加入一抗溶液孵育，4℃過夜，TBST洗膜后，二抗溶液室溫孵育2 h。在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光，使用Image J軟件檢測條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察 鏡下可見空白對照組(圖1A)大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞膜完整，胞核清晰。與空白對照組比較，模型對照組(圖1B)可見腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞密度較大，肝細(xì)胞索排列紊亂，核質(zhì)比大，核染色深，伴炎性細(xì)胞浸潤等病理特征，提示肝癌大鼠模型建模成功。

空白對照組 模型對照組

圖1 大鼠肝臟組織形態(tài)(HE染色，×200)

2.2 5組大鼠Raf、MEK和ERK的A值比較 與B組比較，其他4組大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK的A值升高；M組和H組低于C組，且M組低于H組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肝組織中Raf、MEK和ERK的A值比較(x±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05。

2.3 5組大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 與空白對照組比較，其余4組大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，清肝化瘀顆粒中劑量組和清肝化瘀顆粒高劑量組低于模型對照組，且清肝化瘀顆粒中劑量組低于清肝化瘀顆粒高劑量組(均P<0.05)。見表2及圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK蛋白表達(dá)水平

表2 5組大鼠Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白相對表達(dá)水平比較(x±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05。

3 討 論

近年來，中國肝癌的發(fā)病率和病死率具有逐年上升趨勢[1]，給社會發(fā)展和公共健康帶來極大的負(fù)擔(dān)。肝癌的治療主要以手術(shù)、放療和化療為主，雖然取得一定成果，但患者預(yù)后仍較差，生存率仍未欠滿意。有研究證實，Raf/MEK/ERK信號通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，該通路活化異?？蓪?dǎo)致腫瘤發(fā)生。例如Zhou等[9]發(fā)現(xiàn)，抑制Raf/MEK/ERK信號通路的活化可誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡，阻滯G2/M細(xì)胞周期生長，并抑制細(xì)胞遷移及侵襲；Zhang等[10]認(rèn)為下調(diào)Raf/MEK/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路表達(dá)，可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖；Zhu等[11]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等與Raf/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。Raf、MEK和ERK都是人體內(nèi)常見的蛋白激酶，其中Raf被激活后其C端催化區(qū)與MEK結(jié)合激活MEK，而活化的MEK通過N端區(qū)域與ERK直接連接進(jìn)一步激活ERK。三者在Raf/MEK/ERK通路中發(fā)揮重要的作用，測定Raf、MEK和ERK蛋白表達(dá)水平可反映出Raf/MEK/ERK通路活化情況。

清肝化瘀顆粒主要成分包括苦參、黃芪、白術(shù)、白花蛇舌草、義術(shù)、三棱、半枝蓮、甘草等。苦參主要藥用成分為苦參素，研究顯示苦參素抑制肝內(nèi)炎癥反應(yīng)和肝內(nèi)纖維組織增生，具有免疫調(diào)控、抗炎和抗纖維化功能[12]。黃芪多糖與枸杞多糖聯(lián)用對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用[13]。白術(shù)通過抑制核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件信號通路的活化，從而改善大鼠肝臟脂肪代謝紊亂，減輕肝臟脂質(zhì)蓄積[14]。甘草總黃酮具有抗硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠慢性肝纖維化的作用[15]。白花蛇舌草提取物通過抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)的平衡而起到改善肝損傷的作用[16]。以上研究表明，清肝化瘀顆粒具有肝組織保護(hù)的藥效。

本研究采用飲用含二乙基亞硝胺的滅菌水建立肝癌大鼠模型，組織病理學(xué)提示成功建立肝癌大鼠模型。本研究結(jié)果顯示，肝癌大鼠肝臟組織Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，給予中、高劑量的清肝化瘀顆粒干預(yù)后，上述mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低，且中劑量效果更為明顯，提示一定劑量的清肝化瘀顆粒對Raf/MEK/ERK通路具有抑制作用。清肝化瘀顆粒是由不同成分的中藥組成，其抑制Raf/MEK/ERK通路的活性成分仍不明確，需要進(jìn)一步進(jìn)行其他成分實驗研究或Meta分析才可驗證其作用機制。

綜上所述，清肝化瘀顆?？赏ㄟ^抑制Raf/MEK/ERK信號通路，這或是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機制之一。