辛藝 李新志 周游

三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院（湖北宜昌443001）

骨關(guān)節(jié)炎是一種多發(fā)于老年人的慢性退行性關(guān)節(jié)病，其特點是關(guān)節(jié)軟骨受損和關(guān)節(jié)功能喪失，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和活動受限，其病理特征包括關(guān)節(jié)軟骨細胞減少、軟骨下骨硬化、滑膜炎和軟骨基質(zhì)降解等[1，2]，主要與性別、年齡、肥胖、關(guān)節(jié)損傷、機械性壓力、遺傳等因素有關(guān)[3-5]。自噬是細胞中一種自我保護的動態(tài)回收機制，通過降解受損或功能失調(diào)的細胞器或大分子來回收生物合成的原材料，循環(huán)利用，以實現(xiàn)某些細胞器的更新和細胞本身新陳代謝需要[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展與軟骨細胞自噬相關(guān)基因（autophagy associated gene，ATG）異常表達和自噬功能障礙密切相關(guān)[7，8]。自噬抑制被認為與骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變和軟骨細胞凋亡有關(guān)。軟骨細胞自噬由于具有保護和抗凋亡的功能[9，10]，逐漸成為近年來骨關(guān)節(jié)炎研究的熱點。miRNAs 是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA 分子，大約由22 個核苷酸組成。miRNAs 作為基因表達的重要調(diào)節(jié)因子，通過與特定的mRNAs 的3'-非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）互補結(jié)合，降解mRNA 靶基因或誘導(dǎo)翻譯沉默，介導(dǎo)生物過程中蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。很多研究分析了miRNAs 在骨關(guān)節(jié)炎中的功能和機制，并證實了miRNAs可以調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的自噬[11-13]。

本文就近些年來參與自噬調(diào)控的miRNAs 在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞自噬中的作用及機制做一綜述，以引起對潛在機制的探索，提高對自噬中miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認識，為后期研究提供參考。

1 自噬及其調(diào)控機制

自噬是真核細胞中一個動態(tài)的、連續(xù)的、由溶酶體介導(dǎo)的胞內(nèi)蛋白的降解過程，主要包括以下幾個過程：誘導(dǎo)、成核、延伸、成熟、融合和降解。雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體的形成是細胞自噬的關(guān)鍵。ATGs 在自噬體的形成過程中除了編碼蛋白外，還調(diào)控整個自噬過程，這也是自噬體活動的最重要的形態(tài)學(xué)特點。

自噬過程中涉及許多必要的信號通路，其中PI3K/AKT/mTOR 信號通路最為人熟知，是自噬過程中的主要調(diào)控因子。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是多種信號（氨基酸、ATP 或DNA 損傷）的感受器，作為自噬起點的門戶分子，在自噬過程中發(fā)揮門戶作用。mTOR 可以與Raptor 或Rictor 偶聯(lián)，形成mTOR復(fù)合物1（mTORC1）或mTOR 復(fù)合物2（mTORC2），兩者都能夠調(diào)控自噬[14]的過程。在哺乳動物細胞中，自噬起始于形成一個unc-51 樣激酶（uncoordinated 51-like kinase，ULK）復(fù)合物，該復(fù)合物由ULK1/2、ATG13、ATG101、局部粘著斑激酶（Focal Adhesion Kinase，F(xiàn)AK）和FAK家族激酶相互作用蛋白（FAK-family kinase interacting protein of 200 kDa，F(xiàn)IP200）組成，由Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶/ 絲氨酸/蘇氨酸激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/Protein Kinase B，PI3K/AKT）通路激活的上游信號誘導(dǎo)，結(jié)合的mTOR 和ULK1/2蛋白解離，激活該復(fù)合體內(nèi)各類ATG的磷酸化/去磷酸化，啟動細胞自噬[15]。mTORC1可以整合上游信號，通過結(jié)合ULK 復(fù)合物進一步抑制自噬。隨后形成PI3K 復(fù)合物，該復(fù)合物由Ⅲ類PI3K、Beclin1、ATG14L、p150 等一系列相關(guān)調(diào)節(jié)劑組成，介導(dǎo)自噬體的成核過程，促進自噬體磷脂雙分子膜的形成與延伸。其中，自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1有助于招募并激活各類膜分子，包括Bax 相互作用因子1（bax-interacting factor-1，Bif-1）、紫外線照射耐受相關(guān)基因（ultraviolet resistance-associated gene，UVRAG）、Beclin1 調(diào)節(jié)的自噬激活分子（Autophagy/Beclin 1regulator 1，Ambra1）、Rubicon 蛋白[16]和B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）[17]。最后在膜上形成泛素樣蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)，用于被溶酶體識別。ATG12 和微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）作為泛素樣蛋白分子，在自噬體的延伸和成熟過程中是必需的[16]。ATG16L1-ATG12-ATG5 復(fù)合物是由ATG12、ATG7、ATG10、ATG5、ATG16L1 等多個ATG 連續(xù)偶聯(lián)而成。當LC3 首先被ATG4B 裂解成胞質(zhì)形式（LC3-I）時，LC3-I 依次與ATG7、ATG3、磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，形成一種稱為LC3-II 的脂質(zhì)形式。在此過程中，ATG16L1-ATG12-ATG5 復(fù)合物對LC3 完成后續(xù)的組裝至關(guān)重要。另外兩個重要的結(jié)構(gòu)是跨膜蛋白ATG9和液泡膜蛋白1（vacuole membrane protein 1，VMP1），直接參與復(fù)雜裝配[16]外的延伸和成熟過程。成熟的自噬體與溶酶體融合完成后，形成自噬溶酶體并降解細胞內(nèi)容物。

此外，腺苷酸激活的蛋白激酶（AMP-actived protein kinase，AMPK）是一種高度保守的蛋白質(zhì)，是代謝和能量感受器，直接促進自噬，使軟骨細胞不退變。在ATP/AMP 比值較低的情況下，AMPK 能夠激活ULK1[18]。同時，肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）/AMPK信號通路也能夠通過磷酸化Raptor成分和中間因子結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體1/2（TSC1/2）[19]抑制mTORC1活性，進而誘導(dǎo)自噬。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirtuin-1 ，SIRT1）被認為是一種延長因子，介導(dǎo)衰老和自噬的進程。已有研究表明SIRT1 在AMPK 和mTOR 通路調(diào)節(jié)中的級聯(lián)反應(yīng)[20，21]。此外，由于SIRT1 去乙?；富钚?，可以通過增加LC3-II[22]水平，保護軟骨細胞免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的死亡，也可以干擾乙?；痯53 和下游基因，包括Bax 和Bcl-2[23，24]。事實上，已有研究闡明了骨關(guān)節(jié)炎的致病機制，即軟骨細胞中mTOR 的激活和自噬的抑制[25，26]。

2 軟骨細胞自噬中的miRNA

miRNA 由于其靶基因的廣泛性而成為骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的關(guān)鍵因素。通過靶向特定的ATGs、信號通路或其他相關(guān)蛋白，以及介導(dǎo)軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的干預(yù)，越來越多的miRNA 被認為可以調(diào)節(jié)軟骨細胞自噬的不同過程，見表1。

表1 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞自噬過程中的miRNA及其靶點

2.1 miR-155

綜合組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-155在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中高度上調(diào)[27]。另有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-155通過mTOR信號誘導(dǎo)自噬[28]，基于此，研究人員開展了探索人類軟骨細胞自噬機制的研究并證實miR-155確實通過靶向調(diào)節(jié)ULK1、FOXO3、ATG3、ATG5、ATG14、GABA A 型受體相關(guān)蛋白（Gamma-Aminobutyric Acid Receptor-Associated Protein-Like 1，GABARAPL1）[29]等ATGs，還顯著抑制這些ATGs的mRNA和蛋白水平，從而參與下調(diào)自噬，而沉默miR-155則顯示出相反的作用。同時，miR-155的過表達也降低了LC3-I的轉(zhuǎn)化率，從而影響自噬體的延伸和成熟。然而，通過miR-155抑制mTOR活性并不能下調(diào)軟骨細胞自噬，可能是因為抑制mTOR活性是通過mTORC2 的重要組成部分Rictor[30]實現(xiàn)的，Rictor可能是miR-155的靶點之一，能夠磷酸化AKT并激活mTORC1[31]。

2.2 miR-30b

miR-30 家族在自噬中表現(xiàn)出特殊的作用。據(jù)報道，miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e等家族成員可直接與Beclin1的3-UTR結(jié)合，并對噬菌體成核[32]有很大影響。在所有家族成員中，miR-30b在調(diào)節(jié)軟骨細胞自噬方面最為突出。Chen 等[33]通過TNFα、3-甲基腺嘌呤和雷帕霉素在ATDC5 細胞中構(gòu)建了自噬的分化模型，證實了以miR-30b 為靶點的Beclin1和ATG5的相互作用。與miR-30b過表達相反，其抑制作用最終導(dǎo)致自噬上調(diào)，并抑制細胞凋亡和軟骨降解?？傊?，miR-30b 被認為是可以維持TNF-α誘導(dǎo)的自噬與凋亡平衡的關(guān)鍵因素。Song等[34]進行的另一項研究明確了通過PI3K/AKT/MTOR 抑制軟骨細胞自噬與Beclin1表達下降密切相關(guān)，與骨關(guān)節(jié)炎進展密切相關(guān)。這表明可能存在一種由miR-30b啟動的潛在信號通路，其具體機制在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中尚不清楚。

2.3 miR-146a

Li等[35]發(fā)現(xiàn)了在軟骨細胞凋亡中miR-146a的誘導(dǎo)作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在體外模擬對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的機械壓力，發(fā)現(xiàn)當受到機械性損傷時miR-146a可以靶向作用于Smad4[11]。盡管如此，Smad4被認為與軟骨細胞自噬無關(guān)，而靶基因腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）和白介素受體相關(guān)激酶1（Interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1）與自噬密切相關(guān)[36]。TRAF6 是一種泛素連接酶，在細胞信號傳輸中發(fā)揮作用。激活的TRAF6 可與磷酸化的IRAK1 結(jié)合并啟動NF-κB 信號通路，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨降解過程中介導(dǎo)炎癥性細胞因子和炎癥反應(yīng)[37]。Zhang 等[38]研究者證實了TRAF6和IRAK1是miR-146a的直接靶點，是在低氧誘導(dǎo)軟骨細胞自噬[37]中調(diào)控Bcl-2的中間因子。低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的誘導(dǎo)作用應(yīng)該得到重視。在OA和正常軟骨中都可以檢測到HIF-1，其表達水平可能受到初級細胞因子或生長因子的影響[39]。Beclin1/Bcl-2調(diào)制[40]、AMPK 激活和mTOR 抑制[41]都與HIF-1 誘導(dǎo)的自噬有關(guān)。在低氧狀態(tài)下，阻斷HIF-1后，未觀察到miR-146a增加[38]。一般來說，HIF-1作為上游位點，直接靶向作用于miR-146a，調(diào)節(jié)下游基因并誘導(dǎo)軟骨細胞自噬。

2.4 miR-17-5p

miR-17-5p 是miR-17-92 簇的成員之一，對生長和骨骼發(fā)育至關(guān)重要[42]。近些年來，miR-17-5p在自噬過程中受到越來越多的關(guān)注。固位體1（Sequestosome-1，SQSTM1）作為一種選擇性自噬適應(yīng)蛋白，在泛素介導(dǎo)的蛋白降解中起著重要作用。由于自噬過程中的泛素化途徑，已有研究報道p62的表達降低[43]。最近研究表明，miR-17-5p通過p62促進人軟骨肉瘤細胞的自噬[44]。在細胞實驗中，miR-17-5p的過度表達抑制p62的表達并增加LC3 點，從而激活自噬。另有研究人員也觀察到骨關(guān)節(jié)炎小鼠膝關(guān)節(jié)中LC3斑點降低，p62蛋白水平升高[44]。基于此，我們推測，人骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的miR-17-5p和自噬水平可能都較低。在其他非骨關(guān)節(jié)炎研究中發(fā)現(xiàn)一些ATG 與miR-17-5p 相關(guān)，如ULK1[45]、Beclin1[46]和髓細胞白血病蛋白-1（myeloid cell leukemin-1，mcl-1）[47]。

2.5 miR-21

已有研究報道在髓核細胞[48]中miR-21 對自噬的抑制作用，以及miR-21 在軟骨中有差異表達[49]，但miR-21在軟骨細胞中的研究進展甚微。Song等[50]研究發(fā)現(xiàn)，與正常細胞相比，骨關(guān)節(jié)炎中miR-21表達降低，抑制miR-21導(dǎo)致ATGs和LC3B下調(diào)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)生長阻滯劑特異性轉(zhuǎn)錄5（growth arrest-special transcript 5，GAS5）在軟骨細胞自噬抑制中的關(guān)鍵作用。GAS5 屬于長鏈非編碼RNA（long non - coding RNAs，lncRNAs），作為海綿與一系列miRNAs結(jié)合，阻斷了miRNAs與mRNA之間的相互作用。外源性GAS5的誘導(dǎo)能夠降低miR-21 的表達，導(dǎo)致Beclin1、ATG7、LC3B的下調(diào)，表明自噬[50]水平下降。Zhang等[51]證實了生長分化因子5 （growth diferentiation factor 5，GDF5）是miR-21在軟骨細胞中潛在的下游靶點，并且miR-21 在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中過表達，但是，它們在自噬過程中的靶向性聯(lián)系尚不清楚。關(guān)于miR-21 的高表達，Zhang 等人與Song 等人研究相矛盾，不同的組織來源和OA分期導(dǎo)致了這種分化。前者比較OA軟骨標本與創(chuàng)傷性截肢者軟骨標本，后者比較股骨髁和脛骨平臺軟骨標本，采用相對正常的OA概念。

2.6 其他miRNAs

除了上述已被深入研究的miRNAs 外，一些新型miRNAs逐漸被關(guān)注。miR-9[52]和miR-449a[53]可以直接靶向作用于SIRT1，SIRT1 對軟骨細胞具有保護作用并調(diào)節(jié)自噬。miR-4262 過表達可抑制SIRT1，激活PI3K/AKT/mTOR，最終降低軟骨細胞自噬，誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展[54]。miR-206 靶向作用于胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factors -1，IGF-1），通過PI3K/AKT/mTOR 通路負調(diào)控自噬過程[55]。miR-20[56]在PI3K/AKT/mTOR 通路中的機制與miR- 206 相似。此外，miR-20 還可以靶向調(diào)控ATG10 進而抑制自噬。miR-128a靶向調(diào)控ATG12[57]影響自噬的延伸過程進而觸發(fā)自噬終止。Zhao等[58]在骨關(guān)節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn)miR-107是自噬的啟動子，在miR-107過表達時miR-107可以靶向作用于TRAF3和抑制AKT/mTOR活化。

3 結(jié)論和展望

在軟骨細胞自噬過程中，miRNAs調(diào)控的體內(nèi)平衡紊亂是骨關(guān)節(jié)炎進展的一個關(guān)鍵機制。盡管已經(jīng)取得了一些成果，但對miRNA 在自噬中的干預(yù)作用的理解仍處于起步階段。在ATGs不斷被識別的情況下，在不久的將來，我們將探索ATGs 和其他具有潛在作用的miRNA。隨著生物信息學(xué)預(yù)測的日益普及，在miRNA、靶基因和信號通路之間形成了一個巨大的自噬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。獨立的一對多或多對一的靶向關(guān)系和特異的串擾現(xiàn)象在干擾軟骨細胞自噬過程中起著至關(guān)重要的作用。此外，競爭性內(nèi)源性RNA理論揭示了lncRNA或環(huán)狀RNA上游調(diào)控通路的存在，為miRNA研究開辟了新的領(lǐng)域。參考近期研究，許多l(xiāng)ncRNA可以通過調(diào)節(jié)自噬直接參與骨關(guān)節(jié)炎進展[59，60]。與這些結(jié)果相比，目前還沒有關(guān)于骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中環(huán)狀RNA 的明確或類似的報道。為了更全面地了解軟骨細胞的自噬，迫切需要對環(huán)狀RNA 及其靶向miRNA 進行研究。在維持自噬的治療中，miRNAs的基因干擾已成為一個有希望和必要的方向。在體外和體內(nèi)模型中都對幾種已知的miRNA 進行了干預(yù)，如miR-206 inhibitor 和miR-128a反義寡核苷酸[5，64]，最終實現(xiàn)滿意的自噬恢復(fù)和軟骨細胞存活。然而，自噬并不是決定軟骨細胞命運的唯一因素。OA 進展是整體性的，與軟骨細胞自噬、凋亡和衰老密切相關(guān)，其中miRNA 可能同時參與。考慮到miRNA 的多靶點特性，單一的功能研究似乎無法闡明復(fù)雜的自噬網(wǎng)絡(luò)。在臨床應(yīng)用基因調(diào)控自噬技術(shù)之前，需要對miRNA 調(diào)控的軟骨細胞功能進行全面的研究。