李洋 孫大康 鄭園園 程艷麗

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內科（山東濱州256603）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）導致的心血管疾病是世界范圍內第一大致死因素。脂質沉積和動脈壁炎癥失衡是AS主要特征[1]。氧化脂質的內膜下沉積啟動免疫反應，進一步介導可溶性細胞間黏附分子（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、E-選擇素和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ）等炎性因子的釋放[2，3]，加重炎性損傷。此外，巨噬細胞遷移至內皮下，吞噬大量氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL）而轉化為泡沫細胞[4]，泡沫細胞過度分泌基質金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein，MMP-9）會損害斑塊周圍的纖維帽強度[5]，加劇斑塊的不穩(wěn)定性。隨著疾病的發(fā)展，在慢性炎癥、細胞遷移和增殖、纖維化和鈣化等諸多因素作用下，脆弱的斑塊破裂和隨后的血栓形成最終導致急性心血管疾病的發(fā)生[6]?？紤]到AS 是一種長期的慢性疾病，因此加強AS 的早期預防顯得尤為重要。

研究表明，早期體育鍛煉能顯著降低動脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病率和死亡率[7]，可能與運動改善高脂血癥、2 型糖尿病和高血壓等AS 相關危險因素有關[8]。前期研究發(fā)現，長期游泳運動能夠上調小鼠主動脈血管壁的自噬水平[9]。由于自噬與AS 的發(fā)生、發(fā)展密切相關，有研究顯示銀杏葉提取物可通過上調自噬活性、減輕內質網應激來抑制鏈脲佐菌素誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化[10]。我們推測長期游泳運動可能以一種“自然”的方式激活自噬系統(tǒng)，并在機體對抗AS 發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮保護作用，故本研究采用ApoE-/-小鼠建立動脈粥樣硬化模型，在此過程中通過長期游泳運動進行干預，探討游泳運動對動脈粥樣硬化形成的影響及其作用機制，為AS的防治提供新的分子機制和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級C57BL 小鼠、ApoE-/-小鼠，購買于北京維通利華動物實驗中心，許可證號：SCXK（京）2016-0006。動物飼養(yǎng)符合濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院動物倫理委員會的倫理學標準，所有小鼠飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院實驗動物中心，環(huán)境溫度為21℃。12小時循環(huán)光/暗周期。

1.2 實驗方法

選用8 周齡SPF 級雄性C57BL 小鼠20 只、ApoE-/-小鼠40 只。在適應性喂養(yǎng)1 周后將其隨機分為3 組，定期（2周）測量體重。對照組為C57BL小鼠（n=20），給予正常普通飲食、飲水，不干涉其活動。模型組為AopE-/-小鼠（n=20），給予富含脂質的西方飲食，加速自發(fā)性動脈粥樣硬化斑塊的形成。自由飲水，不干涉其活動。實驗組為AopE-/-小鼠（n=20），給予富含脂質的西方飲食，自由飲水。參考Szostak等人的運動方案[11]，實驗組小鼠在31℃～33℃的水中進行為期12周的游泳訓練（5天/周），訓練時間逐步增加，從第1周的30分鐘開始，逐漸過渡到第3 周的50 分鐘。從第4 周至實驗結束，小鼠每次連續(xù)游泳60分鐘。采用團體游泳訓練刺激運動，兩個水槽各放置10 只小鼠，同時進行游泳鍛煉，每次訓練結束后，用毛巾將小鼠擦干。

1.3 取材

1.3.1 血液標本留取

于末次運動并禁食12 小時后，使用4%水合氯醛0.1 ml/10 g 腹腔注射麻醉小鼠，通過摘眼球收集血液標本，離心后取其上清（3000 rpm，15 min）置于－80℃冰箱保存，用于檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、sICAM-1、MMP-9、IL-6 水平。

1.3.2 主動脈標本的留取

小鼠麻醉后充分暴露手術視野，用輸液器針頭從心尖部插入左心室，用PBS勻速灌流，同時剖開右心房排液，待肝臟變?yōu)榛野咨?，游離主動脈弓至腹主動脈整段血管。每組5只小鼠取主動脈血管組織用4%的福爾馬林固定，用于后續(xù)HE染色及IHC；每組5只小鼠取主動脈血管組織制備冰凍切片用于后續(xù)油紅O 染色；每組10 只小鼠取血管組織保存在－80℃冰箱中，用于后續(xù)Western-Blot及Real-Time PCR分析。

1.4 酶聯免疫吸附實驗（ELISA法）

小鼠血清中TC、TG、sICAM-1、MMP-9、IL-6 水平的測定，均按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 HE染色

血管組織常規(guī)脫水、透明、透蠟、包埋，每隔4 μm連續(xù)制備石蠟切片30 張，每隔10 張取一張行HE 染色。依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、75%酒精5 min，自來水洗。切片入蘇木素染液染3 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗。切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min。切片依次放入無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、無水乙醇Ⅲ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min 透明，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢及圖像采集分析。用Image-ProPlus6.0 軟件對每張切片的AS斑塊面積比進行分析。

1.6 油紅O染色

血管組織每隔10 μm連續(xù)制備冰凍切片30張，每隔10 張取一張行油紅O 染色。將冰凍切片復溫干燥，固定液中固定15 min，自來水洗，晾干。切片入油紅染液浸染8～10 min（加蓋避光），蒸餾水洗；75%酒精稍分化，蒸餾水洗。切片入蘇木素染液染3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗。甘油明膠封片劑封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.7 免疫組化

取材及石蠟切片制備同1.5 所述。將切片放置在60℃烘箱內烘烤45 min，常規(guī)脫蠟、脫水、水化，3%過氧化氫去離子水封閉，室溫下孵育20 min，以去除內源性過氧化物酶活性，檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復，山羊血清封閉，37℃下育孵30 min，一抗（LC3 1︰200、Beclin-1 1∶200）4℃冰箱孵育過夜，二抗37℃下孵育30 min后沖洗，DAB顯色，陽性細胞胞質呈棕黃色；蘇木素復染；酒精脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。圖像采集后用Image-ProPlus6.0軟件進行平均光密度分析。

1.8 Westen-Blot檢測

將小鼠主動脈剪成小碎塊，加入200 μl RIPA 裂解液并用玻璃勻漿器勻漿，充分裂解后離心提取上清，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，按照4︰1加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 分鐘，根據蛋白大小選擇配制合適濃度的SDS- PAGE 分離膠濃度（LC3 15KD12%，Beclin-1 60KD10%），每孔上樣量為20 μg。電泳后300 mA轉膜1小時，5%脫脂奶粉封閉1小時，4℃孵育一抗過夜（抗體濃度均為1∶1000），TBS-T洗滌3次，室溫孵育二抗（1∶5000）1小時，TBS-T洗滌3次，ECL發(fā)光試劑盒顯色，圖像拍照保存。ImageJ 軟件分析蛋白條帶。以GADPH 為內參照標化相關蛋白表達量。

1.9 Real-Time PCR分析

將小鼠主動脈剪碎，玻璃勻漿器勻漿，采用RNAisoPlus 試劑提取組織總RNA，按逆轉錄試劑盒步驟逆轉錄合成cDNA。應用CFX96 Real-Time PCR Detection System 的操作方法，反應體系為20 μl，將PCR 反應液放入儀器中進行擴增，擴增程序為：95℃30 秒，PCR 反應，39Cycles，95℃5 秒，60℃30 秒。數據采用2-ΔΔCT方法計算Beclin-1、LC3、GAPDH mRNA 的相對表達量[12]（表1）。

表1 目的基因的引物序列

1.10 統(tǒng)計學分析

采用Graph Pad Prism7 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，組間對比采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 游泳運動對小鼠體重的影響

實驗開始時3 組小鼠體重基本相同，差異無統(tǒng)計學意義。隨著實驗的進行，與對照組相比，高脂喂養(yǎng)的模型組小鼠體重增加迅速，并于第6 周開始出現顯著差異（P＜0.01）。實驗組小鼠經游泳運動后體重較模型組下降，并于第10 周開始出現顯著性差異（P＜0.05）。實驗結束時，模型組小鼠體重凈增長量較對照組顯著增加（P＜0.01），而實驗組小鼠體重凈增長量較模型組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。如圖1所示。

圖1 各組小鼠體重比較（n=20）

2.2 游泳運動對小鼠血脂及相關炎性因子的影響

模型組ApoE-/-小鼠血清TC、TG 以及炎性因子sICAM-1、MMP-9、IL-6 較對照組顯著增加（P＜0.01），而實驗組小鼠經運動干預后，TC、TG、sICAM-1、MMP-9、IL-6 的水平均較模型組顯著降低（P＜0.01）。如表2所示。

表2 各組小鼠TC、TG、sICAM-1、MMP-9和IL-6水平比較（n=20）

2.3 游泳運動對小鼠AS形成的影響

通過HE染色（圖2）和對斑塊面積的測量（圖3）以及油紅O染色（圖4）可知：對照組小鼠的主動脈中幾乎沒有肉眼可見的病變，血管結構、形態(tài)正常，內膜連續(xù)性完整。與對照組相比，高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠則出現明顯的粥樣斑塊（P＜0.01），在內膜下可清楚地觀察到泡沫細胞聚集和膽固醇晶體沉積。相比之下，實驗組小鼠主動脈內粥樣斑塊病變程度明顯減輕（P＜0.01）。12 周的游泳干預可以部分逆轉實驗組小鼠主動脈病變。

圖2 各組小鼠主動脈橫斷面HE染色（×100）

圖3 各組小鼠主動脈橫斷面斑塊面積比較（n=15）

圖4 各組小鼠主動脈橫斷面油紅O染色（×200）

2.4 游泳運動對小鼠血管自噬活性的影響

圖5 各組小鼠主動脈自噬標記物（Beclin-1、LC3）免疫組化染色（×200）及平均光密度比較（n=15）

在免疫組織化學檢測中，Beclin-1和LC3主要在細胞漿內以棕黃色顆粒陽性表達。本研究結果顯示，模型組中的棕黃色陽性顆粒較對照組減少（P＜0.01）。而與模型組相比，實驗組中的棕黃色陽性顆粒表達顯著增多（P＜0.01），這提示運動訓練增強了小鼠主動脈的自噬活性（圖5）。

此外，我們通過實時RT-PCR和Western-Blot技術進一步驗證了我們的假設。實驗組小鼠主動脈組織中Beclin-1和LC3的mRNA和蛋白水平均顯著升高，與模型組存在顯著性差異（P＜0.01）（圖6、7）。

圖6 各組小鼠主動脈自噬標記物（Beclin-1、LC3）mRNA表達比較（n=5）

圖7 各組小鼠動脈組織自噬標記物（Beclin-1、LC3）蛋白表達比較（n=5）

3 討論

3.1 運動對主動脈自噬水平的影響

自噬是一種復雜的降解途徑，通過溶酶體融合和水解酶的作用來轉運、降解受損的蛋白質或功能障礙的細胞器，在饑餓、肥胖、體力活動增加等能量應激條件下，自噬通常會被激活，分解受損的蛋白質和細胞器，并重新合成新的細胞器和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP），在維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)和影響細胞存活等方面發(fā)揮著重要作用[13]。近些年來，人們發(fā)現運動能夠引起適應性自噬活性增強，并對AS等多種慢性疾病的防治有積極作用。但運動過程中自噬相關的調控機制尚不明確。Beclin-1 是在自噬途徑中影響自噬小體形成與成熟的關鍵物質，其水平的上調通常意味著自噬活性的增強。LC3被ATG4裂解，產生胞質定位的LC3-Ⅰ，該蛋白被泛素樣系統(tǒng)修飾并與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）共價結合形成LC3-Ⅱ，并定位在自噬體膜上。LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值的大小可以衡量自噬水平，其比值的增加說明自噬增強[14]。

本研究中，我們選擇被廣泛應用于AS 模型的ApoE-/-小鼠。在實驗結束時，動脈粥樣硬化模型組小鼠主動脈中的LC3 和Beclin-1 較對照組小鼠在mRNA和蛋白水平均降低，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值減少，這與Ding等[12]的研究一致。Cao等[15]也通過透射電鏡觀察到AS 小鼠主動脈斑塊中自噬小體顯著減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，這表明自噬活性在AS 期間受到抑制。這可能與細胞內大量脂質沉積阻礙了自噬體與溶酶體的融合有關。本研究中，經12 周的游泳運動干預，與模型組小鼠相比，實驗組小鼠LC3和Beclin-1在mRNA和蛋白質水平均有所升高，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值增加，說明運動可以通過提高自噬相關蛋白水平而增加主動脈自噬活性。其原因可能是長期運動產生的機械壓力、能量應激導致多種蛋白質及細胞器受損，自噬適當激活，將受損的胞質內容物清除，抑制氧化應激、炎癥反應等介質誘導的細胞凋亡[16]，提高了細胞對病變部位應激環(huán)境的抵抗力。Green等[17]研究認為，運動引起的間歇性血流動力學刺激能夠增強血管壁的結構和功能，有助于抑制AS 形成。最近研究發(fā)現，規(guī)律的體育鍛煉促進動脈血管內皮細胞一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）磷酸化及一氧化氮（nitric oxide，NO）生成，同時伴隨著自噬標志物，包括Beclin1、LC3、ATG3、溶酶體相關膜蛋白2A（lysosomal-associated membrane protein 2，LAMP2）的升高以及p62水平的降低[18]。綜上可知，長期游泳運動可以提高ApoE-/-小鼠主動脈的自噬水平。但也有研究表明，訓練嚙齒類動物5 天至3 個月后，自噬相關蛋白如ATG5/12 或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值未見明顯變化[19]。研究發(fā)現，不同年齡段的小鼠運動后自噬相關蛋白Beclin-1 和AGT7 的表達也存在差異[20]，這提示運動對自噬的影響是多變的，可能受到運動強度、機體狀態(tài)、營養(yǎng)程度、組織類型等多種因素的影響。

3.2 運動激活的主動脈自噬通過調節(jié)炎癥反應及脂質代謝抑制AS的形成

炎癥反應及脂質代謝異常是AS 發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。正常情況下，細胞內膽固醇的流入與流出存在微妙的平衡關系，這種平衡的破壞導致脂質集聚于內皮下并形成脂質條紋，成為AS早期階段的顯著特征，包括TNF-ɑ、IL-6，IL-1、人單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、MMP-9、sICAM-1在內的多種炎性因子都參與了動脈粥樣硬化的發(fā)病過程[21，22]。

本研究中，我們對ApoE-/-小鼠進行12 周高脂飲食喂養(yǎng)。模型組表現出典型的動脈粥樣硬化表現。在相同的飲食條件下，實驗組進行了早期預防性運動，結果顯示，實驗組小鼠主動脈斑塊負荷明顯減少，膽固醇結晶及泡沫細胞數量顯著減少，說明12周規(guī)律游泳運動對AS的預防有積極作用。

本研究對游泳激活自噬抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的作用機制做了初步探討。結果發(fā)現，游泳運動能改善小鼠體內的脂質代謝異常。模型組除表現出典型的動脈粥樣硬化表現外，其體重及循環(huán)TC、TG 水平更高，這與前人的研究結果一致[11]。而實驗組小鼠經游泳運動，其循環(huán)TC、TG 較模型組顯著降低，說明12 周規(guī)律的游泳運動對脂質代謝調節(jié)有積極作用。Wu 等[23]研究觀點相近，但Cesar 等[24]認為運動引起食物攝入量增加，會削弱運動的抗AS 作用。在Pellegrin[25]的研究中，循環(huán)中TC、TG的濃度不受運動因素的干擾，這與我們的實驗結果不一致。這種差異的主要原因可能與兩個實驗的運動方式和飲食配方不同有關。

值得注意的是，我們發(fā)現在動脈粥樣硬化動物模型中，通過游泳運動能顯著抑制炎癥反應。模型組小鼠的斑塊不僅具有較豐富的脂質核心，同時其循環(huán)中的sICAM-1、MMP-9和IL-6水平顯著高于對照組。而運動組炎性因子的表達水平顯著低于模型組，可能由于游泳運動激活的自噬活動負向調控動脈粥樣硬化模型中的炎癥反應，進而抑制AS的病理進程。大量文獻表明，細胞自噬激活能有效抑制炎癥反應。Jones 等[26]認為，自噬通過調節(jié)炎性因子的分泌而影響微環(huán)境中的免疫應答，一般來說，細胞自噬及其相關蛋白往往對于炎癥反應具有明顯的負調控作用。當自噬調控基因ATG7 被敲除時，脂多糖依賴的炎性小體被激活，并伴隨著IL-1β、IL-18 等多種炎性因子的釋放[27]。但目前為止，細胞自噬抑制炎癥反應的機制尚不明確。一種解釋是，細胞自噬會下調ROS的產生，進而抑制炎癥小體；另一解釋為，自噬會加快凋亡細胞的清除而弱化炎癥反應[28]。Zhou等[29]發(fā)現，桑黃素能夠抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊的形成，并降低其炎性細胞因子（TNFα、sICAM-1、COX-2）水平，其抗炎作用可能與cAMPPRKA-AMPK-SIRT1信號通路誘導自噬激活有關。蛋白酶活性的增加是不穩(wěn)定斑塊的特征之一。運動降低小鼠體內循環(huán)MMP-9 水平，可能有益于斑塊的穩(wěn)定性。Shon等[30]的研究也出現了類似的結果。我們推測游泳運動激活的自噬活動通過負向調控動脈粥樣硬化模型中的炎癥反應，以及調節(jié)機體的脂質代謝，抑制AS的病理進程。

4 結論

游泳運動能夠上調小鼠主動脈血管壁自噬活性，改善ApoE-/-小鼠體內脂質代謝失衡和降低相關炎性因子的水平，有效抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。