林甲換 趙必允 夏臣杰

1 寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院（浙江寧波315100）

2 寧波市鄞州區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（浙江寧波315101）

3 浙江中醫(yī)藥大學(xué)（浙江杭州310053）4 寧波醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院（浙江寧波315041）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一類以骨量流失，骨微結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致骨骼脆性增加的代謝性疾病。高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)（high intensity interval exercise，HIIE）是一種多次短時(shí)間高/低強(qiáng)度間隔的運(yùn)動(dòng)方式。臨床研究表明，運(yùn)動(dòng)具有加速骨質(zhì)形成，提升骨量?jī)?chǔ)備，能有效干預(yù)PMOP[1]。HIIE 作為常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)處方之一，其干預(yù)PMOP 的分子機(jī)制尚不清楚。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨形成及骨穩(wěn)態(tài)平衡維持起到重要作用，其過(guò)表達(dá)或缺失會(huì)導(dǎo)致骨量的激增或驟降[2，3]。深入研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin 信號(hào)通路具有調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化的作用，該通路激活后能夠促進(jìn)MSCs 成骨分化，進(jìn)而改善骨量丟失，是治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)[4，5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HIIE干預(yù)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型，探討HIIE 干預(yù)小鼠PMOP 的療效，并進(jìn)一步探討其對(duì)βcatenin信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雌性10 周齡C57BL/6 小鼠30 只，體重為20 g 左右，由寧波大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。小鼠飼養(yǎng)在濕度為40%± 5%、溫度為23± 2℃、晝夜12小時(shí)更替的環(huán)境下，可自由飲水和進(jìn)食。

1.2 藥物及試劑

戊巴比妥粉（中生瑞泰科技有限公司，中國(guó)），4%多聚甲醛（Solarbio 公司，中國(guó)），阿爾新藍(lán)/蘇木精（Alcian blue/ hematoxylon，ABH）染液（Sigma 公司，美國(guó)），Orange G 染液（Sigma 公司，美國(guó)），Triton X-100（Sigma公司，美國(guó)），檸檬酸鈉緩沖液（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó)），一抗：β-鏈蛋白（β-catenin）（Abcam，美國(guó)），Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2，Abcam，美國(guó)），堿性磷酸酶（ALP，Arigo，中國(guó)），IgG-HRP二抗（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）。

1.3 主要儀器

小鼠跑步儀（Mouse Specifics 公司，美國(guó)），蔡司顯微鏡（Zeiss公司，德國(guó)），Micro-CT（Skyscan 1170，Bruker 公司，比利時(shí)），骨形態(tài)計(jì)量?jī)x（Osteometrics 公司，美國(guó)）。

1.4 小鼠造模[6]及分組

腹腔注射0.3%戊巴比妥（0.1 ml/10 g）麻醉后，常規(guī)備皮，皮膚消毒，于背部正中線做長(zhǎng)約1.5 cm 的切口，沿兩側(cè)背部肋弓緣、腰椎旁逐層進(jìn)入腹腔，暴露兩側(cè)卵巢及輸卵管。其中模型組和運(yùn)動(dòng)治療組各10只，去除雙側(cè)卵巢及結(jié)扎輸卵管；假手術(shù)組10 只，去除雙側(cè)卵巢周圍的等量脂肪組織。檢查腹腔無(wú)活動(dòng)性出血后，縫合切口，并于術(shù)后連續(xù)3d 腹腔注射青霉素。假手術(shù)組和模型組小鼠常規(guī)自由飼養(yǎng)，治療組在此基礎(chǔ)上按既定方案進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

1.5 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

造模手術(shù)后，常規(guī)飼養(yǎng)觀察3 天，第4 天起進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)。運(yùn)動(dòng)治療組小鼠置于小鼠跑步儀上，并按如下參數(shù)進(jìn)行每天30 min 高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)（5 m/min 步行60 s，間隔25 m/min 快跑30 s）[7]。整個(gè)持續(xù)運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)間持續(xù)8周。

1.6 微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro computed tomogra?phy，Micro-CT）掃描分析

各組小鼠安樂(lè)死后，取雙側(cè)股骨遠(yuǎn)端，剔除周圍軟組織，置于Micro-CT 進(jìn)行掃描及三維重建。掃描參數(shù)為：分辨率4000×2672，鋁板0.2 μm，掃描層厚為10 μm。檢測(cè)參數(shù)有：骨密度（BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁間距（Tb.Sp）。

1.7 樣本制作

各組小鼠安樂(lè)死后，取雙側(cè)股骨遠(yuǎn)端，剔除周圍軟組織，PBS清洗后置于4%多聚甲醛中固定72 h。固定后的組織進(jìn)行脫鈣、脫水及石蠟包埋，并將其制作成3 μm厚度的石蠟切片。

1.8 阿爾新藍(lán)/蘇木精（Alcian blue/ hematoxylon，ABH）染色及定量分析

脫蠟復(fù)水完成后，將切片置于ABH 染液染色1 h。0.3%鹽酸酒精分化、1%氨水返藍(lán)后，置于Orange G染液浸洗1 min。純水清洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，透明樹(shù)脂封片。使用骨形態(tài)計(jì)量?jī)x對(duì)染色后的切片進(jìn)行組織形態(tài)定量分析，包括骨小梁面積分?jǐn)?shù)（%）、脂肪空泡面積比（%）和脂肪空泡直徑（μm）。

1.9 免疫組化檢測(cè)及定量分析

脫蠟復(fù)水完成后，將切片浸入檸檬酸鈉緩沖液60°修復(fù)4 h。PBS清洗后，浸于0.3%的Triton X-100溶液10 min，內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶封閉20 min，分別滴加β-鏈蛋白（β-catenin）及其下游成骨蛋白R(shí)unt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）一抗溶液，于4℃孵育過(guò)夜。PBS 清洗后，滴加IgG-HRP 二抗孵育20 min，DAB 液體顯色5 min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。純水清洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，透明樹(shù)脂封片。β-catenin，Runx2 和ALP 蛋白表達(dá)陽(yáng)性時(shí)呈現(xiàn)棕色。在蔡司顯微鏡下隨機(jī)選取切片上的4個(gè)區(qū)域，使用Image-Pro Plus 軟件（Media Cybernetics，美國(guó)）對(duì)上述蛋白的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行平均光密度值（IOD/Area）的定量分析（每個(gè)組至少檢測(cè)3個(gè)不同樣本組織切片）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來(lái)表示。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差（oneway ANOVA）分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)延緩PMOP小鼠骨量丟失

Micro-CT 三維重構(gòu)圖及骨微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示（圖1，表1）：造模8周后，與假手術(shù)組相比，去卵巢后模型組股骨遠(yuǎn)端骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨密度下降，骨小梁稀疏，數(shù)量減少，骨小梁間距增大（P＜0.05），提示去卵巢PMOP 小鼠模型成功建立；與模型組比較，HIIE治療組小鼠骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目和骨小梁間距等參數(shù)均顯著改善（P＜0.05），提示HIIE 能夠有效延緩PMOP小鼠骨量丟失和骨微結(jié)構(gòu)破壞。

圖1 小鼠股骨遠(yuǎn)端三維重構(gòu)圖

表1 小鼠骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較（±s）

表1 小鼠骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較（±s）

BMD：骨密度；BV/TV：骨體積分?jǐn)?shù)；Tb.N：骨小梁數(shù)目；Tb.Sp：骨小梁間距；Tb.Th：骨小梁厚度。* P＜0.05，與假手術(shù)組比較；#P＜0.05，與模型組比較

Tb.Th（mm）0.12± 0.01 0.11± 0.01 0.11± 0.03組別（n=10）假手術(shù)組模型組運(yùn)動(dòng)治療組BMD（mg/mm3）1.20± 0.08 0.94± 0.08 *1.14± 0.11#BV/TV（%）40.10± 6.15 27.50± 3.74 *35.14± 4.26#Tb.N（N/mm）3.41± 0.43 2.46± 0.28 *2.67± 0.16 *#Tb.Sp（mm）0.20± 0.04 0.32± 0.07 *0.27± 0.02 *#

2.2 高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)改善PMOP小鼠股骨遠(yuǎn)端骨髓腔結(jié)構(gòu)

小鼠股骨遠(yuǎn)端病理組織切片經(jīng)ABH 染色后，骨小梁呈橘色，骨髓細(xì)胞呈紫色和脂肪空泡呈白色（黑色三角形標(biāo)記處）。ABH 染色及骨組織形態(tài)計(jì)量分析結(jié)果顯示（圖2，表2）：與假手術(shù)組比較，去卵巢后模型組骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏，髓腔內(nèi)骨髓細(xì)胞排列紊亂及大量脂肪空泡堆積，脂肪空泡平均直徑顯著增加（P＜0.05）；HIIE治療組骨小梁增粗，髓腔內(nèi)骨髓細(xì)胞數(shù)量增多且排列有序，脂肪空泡面積及直徑顯著減?。≒＜0.05）。

圖2 小鼠股骨ABH病理染色（×100）

表2 小鼠骨組織形態(tài)計(jì)量分析（±s）

表2 小鼠骨組織形態(tài)計(jì)量分析（±s）

* P＜0.05，與假手術(shù)組比較；# P＜0.05，與模型組比較

組別（n=10）假手術(shù)組模型組運(yùn)動(dòng)治療組脂肪空泡直徑（μm）23.22± 1.90 32.03± 5.62 *25.43± 3.91 *#骨面積分?jǐn)?shù)（%）22.49± 2.21 13.08± 5.96 *19.62± 5.71#脂肪空泡面積比（%）3.03± 0.66 13.01± 4.95 *6.96± 3.58 *#

2.3 高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)促進(jìn)β-catenin 及其下游成骨蛋白表達(dá)

為明確HIIE 延緩骨量流失及改善骨微結(jié)構(gòu)的分子作用機(jī)制，各組小鼠股骨遠(yuǎn)端病理組織切片進(jìn)行免疫組化染色，并對(duì)陽(yáng)性染色（棕黃色，黑色箭頭標(biāo)記處）進(jìn)行平均光密度值（IOD/Area）量化分析。免疫組化及定量結(jié)果顯示：假手術(shù)組β-catenin 蛋白及其下游的成骨蛋白R(shí)unx2 和ALP 集中表達(dá)在生長(zhǎng)板及軟骨-骨移行交界區(qū)軟骨細(xì)胞。目前，該群細(xì)胞已被證實(shí)具有MSCs 特性，能夠持續(xù)分化為成骨細(xì)胞發(fā)揮成骨作用，是機(jī)體骨穩(wěn)態(tài)維持的重要組成部分[8]。與假手術(shù)組比較，模型組生長(zhǎng)板和軟骨-骨移行交界區(qū)MSCs 的βcatenin、Runx2 和ALP 蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，HIIE 干預(yù)8 周后，相應(yīng)區(qū)域MSCs 的βcatenin、Runx2和ALP蛋白表達(dá)明顯改善（P＜0.05）。

圖3 股骨β-catenin、Runx2及ALP蛋白表達(dá)比較（×100）

表3 β-catenin、Runx2及ALP蛋白定量分析（IOD/Area）（±s）

表3 β-catenin、Runx2及ALP蛋白定量分析（IOD/Area）（±s）

* P＜0.05，與假手術(shù)組比較;# P＜0.05，與模型組比較

組別（n=10）假手術(shù)組模型組運(yùn)動(dòng)治療組ALP 0.032± 0.005 0.012± 0.003*0.026± 0.006*#β-catenin 0.072± 0.017 0.020± 0.005 *0.047± 0.010 *#Runx2 0.058± 0.011 0.016± 0.004*0.033± 0.008*#

3 討論

PMOP是一類與MSCs分化異常密切相關(guān)的代謝性疾病。MSCs具有自我更新及多向分化的潛能，其正常的成骨分化在維持骨穩(wěn)態(tài)環(huán)境中起關(guān)鍵作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，除了常見(jiàn)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）外，生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞也具有MSCs 特性，能夠進(jìn)行成骨分化，是機(jī)體骨形成的重要組成部分。MSCs 表面表達(dá)有雌激素受體，能夠特異性與雌激素結(jié)合，并促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化[10]。絕經(jīng)后，雌激素分泌顯著下降，引起MSCs成骨-成脂分化異常，導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡，是PMOP的重要細(xì)胞學(xué)發(fā)病機(jī)制。

運(yùn)動(dòng)作為一種治療方式，被世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦為抗骨質(zhì)疏松癥非藥物治療的首選方案[11]。臨床上，不同的運(yùn)動(dòng)處方廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療。與其他運(yùn)動(dòng)方式（如中等強(qiáng)度的持續(xù)運(yùn)動(dòng)）相比，HIIE可更好地延緩PMOP患者的骨量丟失，增加骨密度。研究發(fā)現(xiàn)，HIIE 能以合理的生物力學(xué)刺激作用于力負(fù)荷感受器（骨細(xì)胞），經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至MSCs，進(jìn)而影響其成骨-成脂分化[7]。

然而，MSCs 分化調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，受到多個(gè)層面的因素影響，如胞內(nèi)、胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA 轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾等，多個(gè)信號(hào)通路可參與其中。β-catenin作為肌肉骨骼分子開(kāi)關(guān)，能夠決定MSCs 分化命運(yùn)[12]。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，Wnt配體通過(guò)與細(xì)胞膜表面受體Frizzled 和LRP5/6 結(jié)合后，募集Disheveled 和Axin，致使GSK3β-Ckl-Axin-APC 四聚體結(jié)構(gòu)解聚，失去磷酸化β-catenin 的功能，導(dǎo)致胞漿內(nèi)β-catenin 增多，經(jīng)跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)與LEF1/TCF結(jié)合后，激活下游成骨靶基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，體外抑制MSCs 的β-catenin 基因，會(huì)導(dǎo)致其成骨分化和骨礦化形成能力下降[13]。體內(nèi)利用Cre-Loxp系統(tǒng)在MSCs內(nèi)條件性敲除β-catenin基因，小鼠出現(xiàn)骨量丟失、髓腔內(nèi)大量脂肪細(xì)胞堆積等MSCs異常分化的表型[14]。這提示，β-catenin 信號(hào)通路可能是HIIE影響MSCs成骨分化的重要調(diào)控機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用成熟的去卵巢小鼠模型模擬婦女絕經(jīng)后的生理狀態(tài)。Micro-CT 結(jié)果顯示造模后8 周，模型組小鼠骨量較假手術(shù)組明顯下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，表明PMOP 小鼠模型成功建立。運(yùn)動(dòng)干預(yù)延緩PMOP 小鼠骨量丟失，顯著改善了去卵巢小鼠的骨量及骨微結(jié)構(gòu)。組織病理層面，造模組骨小梁稀疏，大量脂肪空泡堆積，HIIE 運(yùn)動(dòng)治療后，脂肪空泡數(shù)量顯著減少，并且被正常的骨髓細(xì)胞及骨小梁結(jié)構(gòu)替代，提示去卵巢造模后，存在MSCs 成骨-成脂分化異常，而HIIE 能夠影響MSCs 向成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而延緩小鼠骨量丟失。Runx2和ALP是Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游成骨靶基因，其中Runx2是MSCs成骨分化的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，ALP具有促進(jìn)羥磷灰石沉積，能夠反映成骨形成能力。免疫組化結(jié)果顯示，去卵巢造模后MSCs 的βcatenin 及下游Runx2 和ALP 蛋白表達(dá)明顯減少，導(dǎo)致MSCs成骨分化減弱，骨形成能力下降，是引起PMOP小鼠骨量流失和骨微結(jié)構(gòu)破壞的潛在分子機(jī)制。HIIE能夠激活β-catenin 信號(hào)通路，促進(jìn)下游的Runx2 和ALP靶基因的表達(dá)，影響MSCs成骨-成脂分化，延緩去卵巢引起的小鼠骨量流失和骨微結(jié)構(gòu)破壞。

4 結(jié)論

高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)激活β-catenin信號(hào)通路及下游Runx2、ALP 成骨基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控干細(xì)胞成骨分化，干預(yù)小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。