黃嵩 王巍 牛燕媚 傅力，

1 天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系（天津300070）

2 天津市天津醫(yī)院康復(fù)科（天津300210）

3 天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)系（天津300070）

有氧運(yùn)動(dòng)在促進(jìn)骨骼肌代謝及重塑中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成而加快修復(fù)受損的骨骼肌[1]。此外，有氧運(yùn)動(dòng)能明顯降低體脂含量并改善機(jī)體脂質(zhì)代謝[2]。但是有氧運(yùn)動(dòng)作用于何種內(nèi)分泌因子增加骨骼肌合成代謝并降低機(jī)體脂肪含量，目前尚不清楚。胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulinlike growth factor 1，IGF-1）是一種具有促生長(zhǎng)作用的內(nèi)分泌性多肽類物質(zhì)，肝臟產(chǎn)生的IGF-1 是血液循環(huán)中的主要來(lái)源[3]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1能增加骨骼肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、加快肌纖維生長(zhǎng)、刺激肌纖維增殖分化，這對(duì)骨骼肌重塑及損傷修復(fù)有促進(jìn)作用[4]。在基因?qū)用嫔希琁GF-1存在6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，其第5外顯子選擇性轉(zhuǎn)錄，另外IGF-1 含有2 個(gè)啟動(dòng)子，分別是啟動(dòng)子1 （promoter 1，P1） 和啟動(dòng)子2 （promoter 2，P2），其3’端含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，因此，IGF-1能編碼多種IGF-1基因轉(zhuǎn)錄子[5]。IGF-1啟動(dòng)子和蛋白編碼區(qū)含有多個(gè)CG位點(diǎn)，它們能發(fā)生不同的甲基化修飾。所謂DNA 甲基化是指在DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。大量研究表明，DNA 甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA 構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而抑制基因表達(dá)[6]。此外，運(yùn)動(dòng)能引起體內(nèi)多種基因的甲基化水平發(fā)生改變，這當(dāng)中的許多基因參與代謝和機(jī)體能量利用，提示運(yùn)動(dòng)通過(guò)影響基因的甲基化水平而調(diào)控機(jī)體能量代謝[7]。但是，迄今關(guān)于運(yùn)動(dòng)能否影響IGF-1的啟動(dòng)子甲基化水平則尚無(wú)定論。

流行病學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，親代所處的生活環(huán)境和生活習(xí)慣能對(duì)后代健康產(chǎn)生影響[8]。高脂飲食能改變大鼠后代胰島β細(xì)胞DNA甲基化修飾從而引發(fā)后代產(chǎn)生肥胖和胰島素抵抗[9]。低蛋白飼料喂養(yǎng)的雄性小鼠，其雄性子代肝臟中參與脂質(zhì)、膽固醇合成的有關(guān)基因表達(dá)增加[10]。這些均提示父源性（F0）的生活習(xí)慣可影響子代生長(zhǎng)發(fā)育，但是有關(guān)運(yùn)動(dòng)干預(yù)父系小鼠對(duì)子代健康的影響卻少有研究。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食/有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)父代C57BL/6 小鼠能影響雄性子代的糖、脂代謝，但該影響僅見(jiàn)于雄性后代[11]。研究發(fā)現(xiàn)，性別差異造成的表型差異與X/Y染色體有關(guān)，X/Y上的基因表達(dá)影響個(gè)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)和疾病易感性[12]。因此，本研究對(duì)父系C57BL/6小鼠進(jìn)行為期6周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，檢測(cè)雄性F1 代小鼠的表型數(shù)據(jù)及IGF-1 表達(dá)和甲基化情況，探究運(yùn)動(dòng)干預(yù)父系小鼠對(duì)雄性子代IGF-1表達(dá)及其甲基化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

8周齡C57BL/6小鼠20只（雌雄各半），購(gòu)買自北京華阜康生物科技股份有限公司，于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)配繁，自由飲水，溫度20～25°C，濕度40%～60%，12 小時(shí)光照。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)選取雌、雄小鼠按1∶1 比例配籠，次日晨檢查雌鼠受孕情況，將孕鼠分籠飼養(yǎng)至分娩。新生鼠（F0）母乳喂養(yǎng)21 天后斷乳，每窩選取2～3 只雄性小鼠為F0 代運(yùn)動(dòng)組（E 組），另2～3 只同窩雄性小鼠為F0 代安靜組（C組）。

1.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

運(yùn)動(dòng)組F0 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，進(jìn)行6 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)：60 分/次，1次/天，5天/周，6周。在6周運(yùn)動(dòng)期間，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度均為12 米/分，相當(dāng)于75% VO2max[13]。安靜組F0 小鼠不進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，其正常生理、生活活動(dòng)不予干預(yù)。6周跑臺(tái)干預(yù)后，運(yùn)動(dòng)組和安靜組小鼠分別與同窩未干預(yù)的雌性小鼠按1∶1 合籠交配，次日晨檢查雌鼠受孕情況，將孕鼠單獨(dú)喂養(yǎng)至分娩。分娩后的小鼠為F1 代。分別從F0 代安靜組與運(yùn)動(dòng)組小鼠后代中各選取11～12只F1代雄性小鼠分為安靜組（CM）和運(yùn)動(dòng)組（EM）作為本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。

1.3 小鼠取材及組織保留

F1小鼠自出生21天后斷乳分籠，且F1代小鼠均處于與F0 代小鼠相同的飼養(yǎng)環(huán)境，正常飲食、自由飲水。不對(duì)其進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，其正常生理、生活活動(dòng)不予干預(yù)。飼養(yǎng)F1 代小鼠至9 周齡時(shí)，將小鼠禁食14～16小時(shí)，每組隨機(jī)取11～12只小鼠，測(cè)量體重及體長(zhǎng)后，經(jīng)腹膜下注射水合氯醛溶液麻醉，摘眼球取血，同時(shí)立即分離股四頭肌組織、肝臟、腎周脂肪、附睪周脂肪，稱重后迅速置于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)入－80°C 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA 檢測(cè)血清IGF-1 水平

各組動(dòng)物所留血樣，靜止30 分鐘后，4°C 離心（3000 rpm，15 分鐘）后提取上清。將0.1 ml 待檢血清加于已包被特異抗體的反應(yīng)孔中，37°C 孵育1 小時(shí)后，加入0.1 ml 稀釋的酶標(biāo)抗體，37°C 孵育1 小時(shí)，洗滌。在各反應(yīng)孔中加入0.1 ml 的TMB 底物溶液以顯色，37°C孵育10～30分鐘。最后在各反應(yīng)孔中加入2M 硫酸50 μl 以終止反應(yīng)。檢測(cè)各孔OD 值，大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

1.5 Real-Time PCR 方法測(cè)定肝臟IGF-1 mRNA 的表達(dá)

Trizol法提取各組動(dòng)物肝臟組織中的總RNA后，以總RNA 為模板，用First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒（TaKaRa）來(lái)合成cDNA 第一鏈，按1∶9的比例用H2O稀釋合成的cDNA，所得稀釋cDNA為Real-time PCR 模板。Real-time PCR 反應(yīng)按照SYBR Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒的說(shuō)明操作（Roche）?？偭?5 μl 的反應(yīng)體系為：Supermix 12.5 μl，5’Primer 0.5μl，3’Primer 0.5 μl，cDNA 0.5 μl，ddH2O 11 μl。IGF-1 反應(yīng)條件設(shè)定為：94°C 高溫變性2 min; 然后以94°C 1 min，55°C 30 s，72°C 30 s，共40個(gè)循環(huán)。所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，GAPDH 為內(nèi)參（見(jiàn)表1）。

表1 Real-Time PCR所用引物

1.6 MeDIP-qPCR 方法檢測(cè)肝組織中IGF-1 基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

1.6.1 肝臟DNA提取及超聲處理

細(xì)胞裂解法提取肝臟DNA 后，用超聲法剪切DNA，剪切的DNA 長(zhǎng)度應(yīng)在200～1000 bp 之間，14，000 rpm 離心10分鐘后提取上清。

1.6.2 DNA 甲基化免疫共沉淀反應(yīng)（MeDIP）

MeDIP 過(guò)程參照文獻(xiàn)[14]，簡(jiǎn)述如下：將100 μl 片段DNA上清1∶1稀釋后加入抗-5-甲基胞嘧啶抗體，室溫下（22～25°C）孵育90～120 分鐘，然后加入與磁珠偶聯(lián)的IgG 抗體室溫下孵育60 分鐘。Input DNA 離心后取上清150 μl，免疫共沉淀DNA（immunoprecipitation DNA，IP DNA）用洗滌緩沖液清洗6 次后加入150 μl 1X TE 緩沖液溶解。將Input DNA 和IP DNA加入150 μl 90%乙醇，12000 rpm 離心30 秒，重復(fù)3次，最后加入溶解緩沖液，離心取上清，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6.3 Real-Time PCR

將上述提取的甲基化DNA 按1∶9 比例用H2O 稀釋，所得稀釋DNA 作為Real-time PCR 模板。Realtime PCR 反應(yīng)按照SYBR Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒的說(shuō)明操作（Roche）。反應(yīng)體系同上所述。啟動(dòng)子1（P1）反應(yīng)條件設(shè)定為：94°C 2 min，94°C 1 min，52°C 30 s，72°C 30 s，40 循環(huán)，啟動(dòng)子2（P2）反應(yīng)條件設(shè)定為：94°C 2 min，94°C 1 min，50°C 30 s，72°C 30 s，40 循環(huán)。儀器采用 Step one and Step one plus Real-Time PCR Systems（Applied Biosystems）。待測(cè)DNA 甲基化狀態(tài)可以通過(guò)Ct 值計(jì)算得到。計(jì)算公式為：%（MeDNA-IP/Total input）= 2^[（Ct（input）-Ct MeDNA-IP）] ×100。實(shí)驗(yàn)所需引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（見(jiàn)表1）。

1.7 Western Blot 檢測(cè)股四頭肌組織與內(nèi)臟脂肪組織IGF-1與IGF-1R 蛋白表達(dá)

NP-40 法提取股四頭肌和內(nèi)臟脂肪組織蛋白：每100 mg 組織加入裂解液500 μl，1×Protease Inhibitor 4 μl 和1× Phosphatase Inhibitor 4 μl，研磨器充分研磨組織，然后于4°C，12000 g 離心40 分鐘，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度后轉(zhuǎn)置－80°C冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)分子量的不同制備不同濃度的分離膠，積層膠均為5%，用微量加樣器加入樣品孔內(nèi)等量的總蛋白，并于一側(cè)加樣孔內(nèi)加入預(yù)染蛋白Marker 10 μl。使用Tris-甘氨酸SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液（250 mmol/L 甘 氨 酸，25 mmol/L Tris-Base，0.1%SDS；pH 7.6），60 V 電壓下電泳30 分鐘后，再轉(zhuǎn)換成100 V 電壓電泳2 小時(shí)。采用濕法電轉(zhuǎn)印（轉(zhuǎn)膜緩沖液：39 mmol/L 甘 氨 酸，48 mmol/L Tris- base，0.037% SDS，20% 甲醇；pH 8.3），30 V，2 小時(shí)。根據(jù)PVDF 膜上預(yù)染蛋白Marker 的轉(zhuǎn)移情況，判斷蛋白轉(zhuǎn)移情況。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 小時(shí)后，用1×TBST 洗滌PVDF 膜，使用含5%BSA的抗體稀釋液分別稀釋一抗。4°C 孵育過(guò)夜。次日用1×TBST 洗膜3 次，每次5 分鐘；用5%脫脂奶粉溶液按照1∶10000 稀釋二抗，室溫孵育1 小時(shí)，再用1×TBST洗膜3次，每次5分鐘；最后用ECL反應(yīng)液作為發(fā)光底物，于暗室內(nèi)進(jìn)行X 光膠片曝光，經(jīng)顯影、定影后觀察分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS13.0 for Windows）處理。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Independentsamplesttest）；計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差（±s），各組間差異性檢驗(yàn)的顯著性水平定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 F1 代雄性小鼠生長(zhǎng)指標(biāo)分析

本實(shí)驗(yàn)以F1雄性小鼠為對(duì)象，檢測(cè)的表型數(shù)據(jù)包括：體重、股四頭肌濕重、股四頭肌濕重/體重比。如表1所示，與CM 組小鼠進(jìn)行對(duì)比，EM 小鼠的體重增加12.76%（CM：15.13± 2.08 g; EM：17.06± 1.37 g，P＜0.05），股四頭肌重量增加23.50% （CM：0.17±0.02 g; EM：0.21± 0.03 g，P＜0.05），股四頭肌濕重/體重（×100）增加9.73%（CM：1.13± 0.09; EM：1.24± 0.12，P＜0.05），內(nèi)臟脂肪重量降低21.21%（CM：0.33± 0.05 g; EM：0.26± 0.03 g，P＜0.05）。

表1 運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組F1代雄性小鼠生長(zhǎng)指標(biāo)數(shù)據(jù)對(duì)比

2.2 F1 代雄性小鼠肝臟IGF-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及表達(dá)結(jié)果

F1 代雄性小鼠血清中IGF-1 含量檢測(cè)結(jié)果如圖1A 所示，EM 組小鼠血清IGF-1 含量較CM 組增加73.15%（CM 組：1316.40± 180.13 ng/ml; EM 組：2279.34± 239.63 ng/ml，P＜0.01），表明父系6周有氧運(yùn)動(dòng)顯著增加子代血清中IGF-1的含量。

F1 代雄性小鼠肝細(xì)胞中IGF-1 mRNA 表達(dá)結(jié)果如圖1B 所示，EM 組雄性小鼠肝細(xì)胞中IGF-1 mRNA的表達(dá)較CM 組增加4.12 倍（P＜0.05）。這表明，父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著增加雄性子代肝細(xì)胞中IGF-1 mRNA的表達(dá)。

圖1 F1代雄性小鼠血清IGF-1和肝臟IGF-1 mRNA水平

2.3 肝細(xì)胞中IGF-1基因啟動(dòng)子甲基化水平

IGF-1基因含有兩個(gè)啟動(dòng)子，F(xiàn)1 代小鼠肝細(xì)胞中IGF-1 甲基化水平檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，EM 組小鼠肝細(xì)胞中P1、P2 甲基化水平較CM 組分別降低38.78%（P＜0.05）和52.80%（P＜0.01）。由此可見(jiàn)，父系6 周有氧運(yùn)動(dòng)顯著降低了雄性子代肝細(xì)胞中IGF-1基因啟動(dòng)子甲基化水平。

圖2 F1代雄性小鼠肝臟IGF-1啟動(dòng)子P1和P2的甲基化水平

2.4 F1代雄性小鼠骨骼肌組織與脂肪組織中IGF-1與IGF-1R蛋白表達(dá)水平

F1 代雄性小鼠骨骼肌細(xì)胞中IGF-1、IGF-1R 蛋白表達(dá)結(jié)果如圖3所示，EM 組小鼠骨骼肌細(xì)胞中IGF-1、IGF-1R 蛋白的表達(dá)較CM 組分別增加83.5%和41.2%（P＜0.05）。EM 組內(nèi)臟脂肪細(xì)胞中IGF-1、IGF-1R 蛋白的表達(dá)與其骨骼肌細(xì)胞中的表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致。如圖4所示，EM組小鼠內(nèi)臟脂肪組織中IGF-1蛋白表達(dá)較CM組升高1.36倍（P＜0.05）；IGF-1R蛋白表達(dá)較CM 組升高87.3%（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，父系6周有氧運(yùn)動(dòng)可顯著促進(jìn)子代骨骼肌組織與脂肪組織中IGF-1、IGF-1R蛋白的表達(dá)。

圖3 F1代雄性小鼠股四頭肌中IGF-1和IGF-1R的蛋白表達(dá)水平

圖4 F1代雄性小鼠內(nèi)臟脂肪中IGF-1和IGF-1R的蛋白表達(dá)水平

3 討論

本研究主要探究父系6周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)子代雄性小鼠IGF-1 表達(dá)及其甲基化的影響，通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)雄性C57BL/6 小鼠，采用生長(zhǎng)指標(biāo)的檢測(cè)等方法研究其子代（F1）小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的差異，采用分子生物學(xué)技術(shù)分析子代（F1）小鼠生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生差異的分子機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)子代雄性小鼠體重及股四頭肌的增加，并可降低內(nèi)臟脂肪組織的堆積。在分子層面上，父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可降低子代雄性小鼠肝細(xì)胞IGF-1基因的甲基化水平，增加子代血清中IGF-1含量及肝細(xì)胞IGF-1 的mRNA 水平，并增加子代股四頭肌和內(nèi)臟脂肪組織中IGF-1 和IGF-1R 的蛋白表達(dá)水平，提示父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)降低IGF-1 啟動(dòng)子甲基化而增強(qiáng)IGF-1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，從而促進(jìn)子代雄性小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.1 父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)子代雄性小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EM組雄性小鼠的體重及股四頭肌重量顯著高于CM 組，然而其內(nèi)臟脂肪組織重量卻顯著低于CM 組（表1）。骨骼肌約占全身重量的40%以上，它不僅在機(jī)體運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，還在維持機(jī)體能量代謝平衡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[15]。骨骼肌組織具有高度的可塑性，其生長(zhǎng)發(fā)育受到多種因素的影響。而規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)，不僅可加快機(jī)體能量代謝、改善機(jī)體糖、脂代謝紊亂，而且還可調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育。此外，脂肪組織不僅可以儲(chǔ)存能量，它還可以分泌多種因子調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)及代謝，內(nèi)臟脂肪組織可以釋放大量細(xì)胞因子及游離脂肪酸，其代謝功能更強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以有效地促進(jìn)脂肪酸的分解，降低體脂含量并改善與肥胖相關(guān)的代謝性疾病[2]。而我們的前期研究也表明，高脂飲食/有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)父代C57BL/6 小鼠能影響雄性子代的糖、脂代謝，且該影響僅見(jiàn)于雄性后代[11]。因此，我們的結(jié)果提示6周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)增加骨骼肌組織重量并降低內(nèi)臟脂肪組織重量而促進(jìn)子代雄性小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.2 父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)子代小鼠肝細(xì)胞IGF-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控及表達(dá)水平的影響

IGF-1是一種由70個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽激素蛋白，其結(jié)構(gòu)與胰島素相似，是一種具有促進(jìn)生長(zhǎng)作用的內(nèi)分泌因子[3，16]。血液循環(huán)系統(tǒng)中的IGF-1主要是由肝細(xì)胞產(chǎn)生分泌的，而肝細(xì)胞中的IGF-1 是在生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）刺激下誘導(dǎo)完成的，GH對(duì)機(jī)體的作用主要由IGF-1 介導(dǎo)完成，形成GH/IGF-1 軸[17]。骨骼肌等組織也可以自分泌或旁分泌產(chǎn)生IGF-1，但是，組織中的IGF-1 mRNA 表達(dá)來(lái)自組織細(xì)胞本身的基因，與血液循環(huán)系統(tǒng)無(wú)關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可通過(guò)增加骨骼肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、加快肌纖維生長(zhǎng)、刺激肌纖維增殖分化而促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)[4]。其他研究也表明，GH 促進(jìn)骨骼肌的生長(zhǎng)是通過(guò)肝組織產(chǎn)生IGF-1介導(dǎo)的[18]，但是運(yùn)動(dòng)是否能調(diào)控IGF-1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)從而調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)則尚無(wú)定論。本研究結(jié)果表明，EM 組小鼠血清中IGF-1 含量及肝細(xì)胞中IGF-1 的轉(zhuǎn)錄水平都顯著高于CM 組（圖1），這說(shuō)明父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能增加子代雄性小鼠肝臟中IGF-1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。另一方面，相比于CM 組，本實(shí)驗(yàn)中EM 組小鼠股四頭肌重量與濕重比分別增加23.50%、9.73%，內(nèi)臟脂肪重量降低21.21%。綜合EM 組IGF-1 的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的增加，這提示子代小鼠骨骼肌重量的增加、內(nèi)臟脂肪組織含量的降低與IGF-1 含量增加密切相關(guān)，父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能增加子代小鼠IGF-1 的表達(dá)水平從而促進(jìn)子代小鼠骨骼肌的生長(zhǎng)。

3.3 父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)子代雄性小鼠肝細(xì)胞IGF-1基因啟動(dòng)子甲基化水平的影響

基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化是DNA 甲基化修飾的重要組成部分，研究發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子甲基化能引起啟動(dòng)子區(qū)與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而影響基因表達(dá)[6]。由環(huán)境因素和運(yùn)動(dòng)干預(yù)引起的DNA 甲基化水平的改變可能是代謝及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一種重要調(diào)節(jié)因素[7]。IGF-1作為一種調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)的內(nèi)分泌因子，其基因的轉(zhuǎn)錄由兩個(gè)啟動(dòng)子（P1與P2）調(diào)控，雖然運(yùn)動(dòng)能影響很多基因的甲基化修飾，但是有關(guān)運(yùn)動(dòng)能否調(diào)控IGF-1 啟動(dòng)子的甲基化卻鮮有報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，EM組小鼠肝細(xì)胞中P1、P2甲基化水平較CM組分別降低38.78%（P＜0.05）和52.80%（P＜0.01）（圖2），鑒于子代雄性小鼠肝臟中IGF-1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平增加（圖1），這表明父系6周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)降低子代雄性小鼠肝臟中IGF-1兩個(gè)啟動(dòng)子的甲基化水平從而增加了IGF-1基因的表達(dá)水平。

3.4 父系6 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)子代雄性小鼠骨骼肌與脂肪組織中IGF-1與IGF-1R蛋白表達(dá)的影響

如前所述，IGF-1在促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)及重塑方面有重要作用[4，18]。近年研究也表明，限制飲食后骨骼肌纖維大小降低與IGF-1/IGF-1R 信號(hào)通路有關(guān)[19]。此外，IGF-1/IGF-1R 信號(hào)通路還能調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和體脂沉積，從而改善脂肪代謝[16]。但是關(guān)于運(yùn)動(dòng)是否能影響骨骼肌與脂肪組織中的IGF-1/IGF-1R 信號(hào)通路則不是十分明確。我們的研究結(jié)果顯示，EM組小鼠其股四頭肌和內(nèi)臟脂肪組織中的IGF-1/IGF-1R 表達(dá)均比CM 組顯著增高（圖3，圖4），表明父系6 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能增強(qiáng)子代雄性小鼠骨骼肌和脂肪組織中的IGF-1/IGF-1R 信號(hào)通路，而EM 組小鼠股四頭肌組織重量的增加與內(nèi)臟脂肪組織重量的下降可能與此有關(guān)。

3.5 6 周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)父代本身的影響通過(guò)遺傳因素作用于子代

許多研究已經(jīng)證明[20-23]，運(yùn)動(dòng)能顯著增加IGF-1的基因及蛋白表達(dá)水平。Eliakim 等的結(jié)果更是表明[21]，在同等運(yùn)動(dòng)條件下的男性與女性相比，男性血液中IGF-1的表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后顯著增加，提示性別對(duì)運(yùn)動(dòng)影響IGF-1水平的作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中，考慮到雄性性染色體-Y 染色體在性別遺傳中的重要因素并為了探究父系運(yùn)動(dòng)對(duì)子代的影響，我們選擇F1代雄性小鼠作為研究對(duì)象。如本研究結(jié)果所示，F(xiàn)1 代EM 組小鼠與CM組相比，其肝細(xì)胞IGF-1啟動(dòng)子甲基化水平降低從而增加了IGF-1的基因及蛋白表達(dá)水平，且EM組小鼠體重及股四頭肌重量均顯著增加，骨骼肌及脂肪組織中的IGF-1/IGF-1R 信號(hào)通路增強(qiáng)，這表明IGF-1 的表達(dá)增加促進(jìn)了F1代EM組小鼠的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育。由于F1小鼠自出生后就一直處于安靜的條件下飼養(yǎng)，無(wú)論EM 組還是CM 組，在其成長(zhǎng)的9 周內(nèi)均未對(duì)其進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。因此EM 組相比CM 組如此顯著的表型變化只能是來(lái)自于先天遺傳物質(zhì)的改變，即F0代的遺傳因素。鑒于運(yùn)動(dòng)能直接增加父代IGF-1的表達(dá)水平[22]，我們的結(jié)果表明了F1 代EM 組的表型遺傳于F0代E組所受的6周父系有氧運(yùn)動(dòng)，性別遺傳中的Y染色體遺傳在運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)IGF-1 啟動(dòng)子甲基化水平降低、促進(jìn)IGF-1基因表達(dá)從而促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育方面具有重要作用。

本研究通過(guò)探討6周父系有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)子代雄性小鼠IGF-1甲基化水平及IGF-1表達(dá)水平的影響，驗(yàn)證了有氧運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)降低IGF-1 甲基化水平從而促進(jìn)IGF-1的基因和蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)并減少內(nèi)臟脂肪組織的含量，因此本實(shí)驗(yàn)解決了運(yùn)動(dòng)能否影響IGF-1甲基化水平的問(wèn)題。而在父系有氧運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)IGF-1表達(dá)過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明遺傳因素起到了重要作用，父系有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)通過(guò)遺傳物質(zhì)的改變來(lái)影響子代的表型，這是本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新之處。然而，本實(shí)驗(yàn)也存在不足之處。運(yùn)動(dòng)促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的因素十分復(fù)雜，除了通過(guò)影響IGF-1的表達(dá)外，運(yùn)動(dòng)還影響許多其他生長(zhǎng)因子及信號(hào)通路。限于條件有限，本研究?jī)H以IGF-1 為切入點(diǎn)。因此，在未來(lái)探究運(yùn)動(dòng)影響機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的研究中，除了關(guān)注IGF-1 這個(gè)已知的信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)，研究者還應(yīng)關(guān)注其他影響機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的信號(hào)通路，如mTOR 信號(hào)通路及AMPK 信號(hào)通路等。另一方面，未來(lái)探究遺傳因素在介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的研究中，研究者可以具體從Y染色體的形態(tài)變化、基因改變等方面入手去探討Y染色體如何具體承載父系運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)子代的影響，以期在遺傳水平上做出深入揭示。

4 結(jié)論

在個(gè)體水平上，6周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)父系小鼠增加了子代雄性小鼠骨骼肌重量，降低內(nèi)臟脂肪組織重量，促進(jìn)子代雄性小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。在分子水平上，6周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)父系小鼠增加了子代雄性小鼠骨骼肌、內(nèi)臟脂肪組織中IGF-1/IGF-1R的蛋白表達(dá)，增加了子代雄性小鼠肝臟IGF-1的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，但降低了IGF-1啟動(dòng)子的甲基化水平。提示父系6周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過(guò)降低肝臟IGF-1 的P1、P2 甲基化水平而增加其基因轉(zhuǎn)錄及其在骨骼肌、內(nèi)臟脂肪中的蛋白表達(dá)，從而顯著促進(jìn)子代雄性小鼠骨骼肌組織生長(zhǎng)并減少其內(nèi)臟脂肪堆積，從而促進(jìn)子代雄性小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。