王 蓉， 黃克亮， 張建華， 張 欣

（1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院檢驗科，上海 200011；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，上海 200025）

脂蛋白殘粒（remnant lipoprotein，RLP）是乳糜微粒和極低密度脂蛋白（very lowdensity lipoprotein，VLDL）在脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）的作用下，大量三酰甘油（triglyceride，TG）、磷脂、載脂蛋白（apolipoprotein，apo）A和apo C水解后形成的富含膽固醇酯和apo E的相對較小的高密度殘粒，是富含TG的脂蛋白 （triglyceride-rich lipoprotein，TRL）[1]。有研究結(jié)果顯示，RLP與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，動脈粥樣硬化會使RLP、TG和VLDL濃度升高，導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生[2]。目前，檢測血清脂蛋白殘粒膽固醇（remnant lipoprotein-cholesterol，RLP-C）濃度的方法較多，如超速離心法、瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）、免疫沉淀分離法等。超速離心法技術(shù)要求高，很難常規(guī)開展[3]，瓊脂糖凝膠電泳難以對RLP-C進行準確的定量檢測[4]，PAGE靈敏度欠佳。本研究參考MIYAUCHI等[5]報道的檢測血清RLP-C濃度的方法（均相法），以表面活性劑聚氧乙烯-聚氧丁烯嵌段共聚物（polyoxyethylenepolyethylene oxide butene，POE-POB）為屏蔽劑，建立檢測RLP-C濃度的方法并初步進行臨床應(yīng)用評價。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年3—11月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院混合性高脂血癥患者116例（混合性高脂血癥組），其中男46例、女70例，年齡24～88歲。納入標準：根據(jù)《中國成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）》[6]中的臨床分類方法，將總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG濃度均升高的患者（TC≥6.22 mmol/L、TG≥1.7mmol/L）納入混合性高脂血癥組。另選取同期上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院黃浦分院體檢健康者50名（正常對照組），其中男28名、女22名，年齡24～88歲。

1.2 方法

采集所有研究對象空腹12 h的靜脈血5 mL。采用氧化酶法測定TC、TG，試劑盒購自德國西門子公司。采用免疫比濁法測定apo C2，試劑盒購自寧波瑞源公司。采用均相法檢測RLP-C，參比試劑購自日本協(xié)和公司，自建方法試劑由本實驗室自配，檢測儀器為ADVIA CENTAUR XPT全自動生化分析儀（德國西門子公司）。TC、TG質(zhì)控品（批號：M806001～M806003）由上海市臨床檢驗中心提供，apo C2質(zhì)控品（批號：201903260）購自寧波瑞源公司，RLP-C質(zhì)控品（批號：145AFC）購自日本協(xié)和公司。

1.3 自建方法試劑的配制

1.3.1 3-（N-瑪代琳）丙磺酸（3-morpholinopropanesulfonic acid，MOPS）緩沖液的配制 MOPS 4.12 g，無水醋酸鈉0.656 g，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）0.584 5 g，蒸餾水800 mL，加入2 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至6.8。

1.3.2 試劑1配制 硫酸鈉1 g/L，牛血清白蛋白1 g/L，POE-POB（由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室合成）8 g/L，N-乙基-N-（2-羥基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺鈉鹽0.15 g/L，過氧化物酶5 kU、抗維生素C氧化酶200 U，溶于500 mL MOPS緩沖液（pH值6.8）中。

1.3.3 試劑2配制 4-氨基安替比林0.05 g/L，氧丙烯烴基醚2 g/L，過氧化物酶1 kU，膽固醇酯酶100 U，膽固醇氧化酶300 U，磷脂酶-D 500 U，溶于100 mL MOPS緩沖液（pH值6.8）中。

1.4 自建方法的測定原理

POE-POB可與高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，LDL）、VLDL等脂蛋白結(jié)合，修飾脂蛋白結(jié)構(gòu)，有效屏蔽非脂蛋白殘粒，經(jīng)過特殊修飾的脂蛋白殘粒與水在膽固醇酯酶的作用下生成游離膽固醇和脂肪酸，游離膽固醇在膽固醇氧化酶的作用下，生產(chǎn)膽甾烯酮和雙氧水，并經(jīng)Trinder反應(yīng)產(chǎn)生色源顯色，通過測定紅色醌亞胺色源在主波長600 nm/副波長700 nm下的吸光度（A）值變化，計算出血清RLP-C濃度。

1.5 RLP-C的檢測參數(shù)

主波長600 nm，副波長700 nm，溫度37 ℃，血清7.8 μL，試劑1 75 μL，試劑2 25 μL，用ΔA值表示反應(yīng)速度。RLP-C濃度的計算公式為：RLP-C（mg/L）=ΔA樣本/ΔA校準品×C校準品；式中ΔA樣本為樣本A值的變化值；ΔA校準品為校準品A值的變化值；C校準品為校準品濃度（mg/L）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用Pearson相關(guān)分析評估各項目之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 緩沖液選擇 配制濃度均為0.02 mol/L的MOPS緩沖液、羥乙基哌嗪乙磺酸｛2-[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid，HEPES｝緩沖液、Tris-HCl緩沖液，其他條件不變，檢測3份不同的血清樣本。結(jié)果顯示，MOPS緩沖體系的ΔA值最高。因此，最佳緩沖體系確定為MOPS緩沖體系。見圖1。

圖1 不同緩沖體系每分鐘的ΔA值

2.1.2 反應(yīng)最適pH值選擇 MOPS緩沖體系固定為20 mmol/L，配制pH值4.0～8.0的MOPS緩沖液，同時與1份樣本作用，結(jié)果顯示pH值6～7時A值最高，反應(yīng)活性最高。因此，反應(yīng)最適pH值確定為6.8。見圖2。

圖2 不同pH值的MOPS緩沖液每分鐘的ΔA值

2.1.3 最適MOPS緩沖體系的選擇 在pH值6.8的條件下，分別用0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.06 mol/L MOPS緩沖液配制試劑，測定1份混合血清。結(jié)果顯示，反應(yīng)速度（ΔA值）隨著MOPS濃度的增加而增加，當MOPS＞0.02 mol/L后，其濃度對反應(yīng)速度（ΔA值）影響不大。最終選擇的緩沖液濃度為0.02 mol/L。見圖3。

圖3 不同濃度MOPS緩沖液每分鐘的ΔA值

2.1.4 POE-POB濃度的選擇 分別采用濃度為1、2、4、6、8、12 g/L POE-POB與20 mmol/L MOPS緩沖液組成反應(yīng)體系，測定10份混合血清。結(jié)果顯示，10份混合血清樣本的RLP-C濃度隨POE-POB濃度的升高而降低，但POE-POB＞8 g/L后對RLP-C濃度的影響較低，因此POEPOB最適濃度為8 g/L。見圖4。

2.1.5 不同濃度RLP-C對POE-POB的屏蔽實驗 將RLP-C濃度分別為725、441、163 mg/L的血清樣本按0.1、0.2、0.3、……、1.0倍稀釋，采用8 g/L POE-POB及20 mmol/L MOPS緩沖液組成的反應(yīng)體系進行檢測。結(jié)果顯示，3份血清樣本檢測結(jié)果均呈線性，r值分別為0.998 6、0.998 7、0.993 5，提示POE-POB濃度為8 g/L已足夠。見圖5。

圖4 不同濃度POE-POB對RLP-C濃度的影響

圖5 不同濃度RLP-C對POE-POB的屏蔽實驗

2.1.6 反應(yīng)時間的選擇 取RLP-C為254 mg/L的樣本，加入試劑1混合孵育5 min，再加入試劑2混合孵育5 min，每14 s讀取1次A值，直至10 min。結(jié)果顯示5～10 min時，A值呈線性（r=0.998 6），故確定延遲時間為5 min，測定時間為5 min。見圖6。

2.1.7 POE-POB屏蔽性能驗證 采用參比試劑與自配試劑分別檢測98例樣本，RLP-C檢測結(jié)果分別為46（30～79）、66（51～110）mg/L。2種方法的相關(guān)性良好，回歸方程為Y=-1.255+0.846X（r=0.980），見圖7。繪制Bland-Altman散點圖，結(jié)果顯示98例樣本中僅有4例（4.08%）檢測結(jié)果的偏移較大，不在±1.96s范圍內(nèi)。見圖8。

圖6 酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測時間的ΔA值

圖7 自配試劑與參比試劑檢測RLP-C的線性

圖8 自配試劑與參比試劑的Bland-Altman散點圖

2.2 精密度實驗

取RLP-C濃度為49、153和267 mg/L的3份樣本，分別進行批內(nèi)、批間各20次測定。結(jié)果顯示，批內(nèi)平均變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為3.37%，批間平均CV為4.91%。見表1。

2.3 穩(wěn)定性試驗

將自配試劑放入4 ℃冰箱，以每天新鮮配制的試劑作為對照。將血清分裝成30份后-20 ℃保存，每天取1份樣本復(fù)融后分別用上述2種試劑檢測試劑中酶自然失活的情況，共記錄30 d。結(jié)果顯示30 d內(nèi)，4 ℃儲存的試劑檢測血清樣本的A值從0.161降至0.159。因此，自配試劑開瓶后放置4 ℃冰箱，可穩(wěn)定1個月。

表1 精密度實驗結(jié)果

2.4 反復(fù)凍融試驗

選取8份新鮮血清樣本，封口，-80 ℃冷凍保存30 min后取出，置于室溫（25 ℃）下融解，并檢測血清RLP-C濃度，反復(fù)凍融4次。結(jié)果顯示，8份血清樣本每次凍融后RLP-C濃度的平均下降比例為3.00%～14.58%。反復(fù)凍融對血清RLP-C濃度的影響較大。見表2。

2.5 初步臨床應(yīng)用

2.5.1 混合性高脂血癥組與正常對照組各項血脂指標的比較 混合性高脂血癥組血清RLP-C、TG、apo C2、TC濃度均高于正常對照組（P＜0.001）。見表3。

表2 8份血清樣本反復(fù)凍融對RLP-C濃度的影響

表3 混合性高脂血癥組與正常對照組血清RLP-C、TG、apo C2和TC濃度比較

2.5.2 混合性高脂血癥組RLP-C、TG、apo C2、TC之間的相關(guān)性分析 RLP-C與TG呈正相關(guān)（r=0.496，P＜0.001），與apo C2、TC均無相關(guān)性（r值分別為0.157、-0.090，P＞0.05）。TG與apo C2呈正相關(guān)（r=0.650，P＜0.01），與TC無相關(guān)性（r=-0.010，P＞0.05）。apo C2與TC無相關(guān)性（r=-0.141，P＞0.05）。

3 討論

RLP的致動脈粥樣硬化作用被認為比LDL更強，其與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-8]，但其致病機制尚不完全清楚。有研究結(jié)果顯示，RLP可能通過損傷內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)單核細胞黏附于血管內(nèi)皮，促進血栓形成，增強血小板活化并刺激血管平滑肌細胞的增殖[9]。與LDL不同，RLP可被巨噬細胞直接吞噬而不被氧化，導(dǎo)致泡沫細胞的形成[10]。血清RLP-C、TG、VLDL-C濃度升高和HDL-C濃度降低可能是動脈粥樣硬化和心腦血管疾病的獨立危險因素[11-12]。因此，RPL對心腦血管疾病的臨床預(yù)測和評估具有重要價值。本研究自行配制了檢測RLP-C的試劑，將自配的表面活性劑POE-POB和磷脂酶D協(xié)同作用，選擇性地修飾RLP，磷脂酶D則作用于脂蛋白磷脂，催化水解極性區(qū)，使其溶于反應(yīng)體系中，形成溶解態(tài)的殘粒樣脂蛋白，其中的膽固醇酯參與后續(xù)反應(yīng)，在表面活性劑、磷脂酶D、膽固醇酯酶等多種酶的共同作用下將除RLP以外的其他脂蛋白排除，使非脂蛋白殘粒不溶于反應(yīng)體系中。自建方法的檢測結(jié)果與參比試劑相差約14%，但相關(guān)性良好（r=0.980），原因可能與2種試劑使用的表面活性劑不同有關(guān)。通過Bland-Altman散點圖可以發(fā)現(xiàn)，2種方法超過±1.96s范圍的數(shù)據(jù)比例＜5%，說明2種方法可以相互替代，證明POE-POB對于非脂蛋白殘粒具有特異性屏蔽作用。

本研究結(jié)果顯示，自建方法的最佳緩沖液為0.02 mol/L MOPS緩沖液，最佳pH值為6.8，POE-POB濃度為8 g/L，檢測時間為10 min，批內(nèi)CV為3.37%，批間CV為4.91%，試劑穩(wěn)定性良好。值得注意的是，試劑1和試劑2配制時因均含有表面活性劑，顆粒狀試劑在水溶液中不易溶解，需充分攪拌溶解，且注意消泡。本研究結(jié)果還顯示，反復(fù)凍融對血清RLP-C濃度的影響較大，測定值明顯下降，因此用于RLP-C檢測的樣本宜新鮮，不宜反復(fù)凍融。

本研究采用自建方法檢測混合性高脂血癥患者和正常對照者的血清RLP-C濃度，結(jié)果顯示混合性高脂血癥患者血清RLP-C濃度高于正常對照組（P＜0.001），且RLP-C與TG呈正相關(guān)（r=0.496，P＜0.001），與宋云霄等[13]的研究結(jié)果一致。這說明RLP-C是較為恒定的生物標志物。后續(xù)將對高脂血癥患者按性別進行分層分析，以深入了解該指標在高脂血癥中的作用。

綜上所述，本研究選用的表面活性劑POEPOB對脂蛋白殘粒有較好的選擇特異性，基于此建立的檢測方法簡便、快速，敏感性高、穩(wěn)定性好，且適用于全自動生化分析儀。