原永明， 章曉鷹， 顧 超， 張 玨， 孫學(xué)華

（1.上海大華醫(yī)院檢驗科，上海 200237；

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗科，上海 201203；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝炎科，上海 201203）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是肝硬化與肝癌的重要危險因子。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的預(yù)后轉(zhuǎn)歸取決于病毒-宿主的相互作用[1]。HBV具有4個開放閱讀框（open reading frame，ORF），分別為S、C、P、X，其中S ORF包含前S1（pre-s1）、前S2（pre-s2）和S區(qū)域，編碼3個HBV表面糖蛋白，分別為小蛋白表面抗原（由S基因編碼）、中蛋白表面抗原（由S和pre-s2基因編碼）和大蛋白表面抗原（由S、pre-s2和pre-s1基因編碼）[2]。S蛋白即乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），由226個氨基酸組成，由于S蛋白不僅僅有B細(xì)胞表位[3]，還含有輔助T細(xì)胞（helper T cell，Th）表位與細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位[4]，因此S蛋白在宿主相關(guān)的免疫功能刺激中扮演了重要角色[2]。S蛋白變異還能影響病毒顆粒和表面蛋白的分泌，可通過誘導(dǎo)表面抗原合成的不平衡使S蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中停留，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急反應(yīng)，這一機制可能與肝臟疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)[5-7]。目前，關(guān)于我國CHB患者和肝硬化患者S蛋白變異特征及其與CHB嚴(yán)重程度相關(guān)性的報道較少。為此，本研究擬探討CHB患者和肝硬化患者S蛋白變異的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2019年3月于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝炎科就診的CHB患者114例，其中男70例、女44例，年齡5～76歲。參照《慢性乙型肝炎防治指南》[1]，將患者分成慢性HBV攜帶組（41例）、非活動性HBsAg攜帶組（38例）和肝硬化組（35例）。慢性HBV攜帶者定義為無特殊癥狀、HBsAg陽性、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陽性、HBV DNA高載量（HBV DNA＞107IU/mL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）正常、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）正常[1]。非活動性HBsAg陽性者定義為HBsAg陽性、HBeAg陰性、乙型肝炎e抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）陽性、HBV DNA＜2×103IU/mL[1，8]。肝硬化診斷參照中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會與感染病學(xué)分會發(fā)布的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。所有患者均排除合并其他病毒，如丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）等感染。

1.2 儀器和試劑

DNA提取試劑盒、DNA第1次純化試劑盒購自德國QIAGEN公司，DNA第2次純化試劑盒購自美國Applied Biosystems公司。ABI 3500 Dx Genetic Analyzer基因測序儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采用乙二胺四乙酸抗凝管采集所有對象靜脈血3 mL，離心分離血漿。

1.3.2 HBV DNA提取 取200 μL血漿，按試劑盒說明書要求提取HBV DNA。

1.3.3 引物設(shè)計 按Genbank數(shù)據(jù)庫中的HBV DNA（HBV genotype B DNA，complete genome，LC0362263；HBV genotype C DNA，complete genome，AB644286）S區(qū)序列，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列見表1。2種引物均涵蓋整個S蛋白。

表1 HBV NDA S區(qū)引物序列

1.3.4 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)條件及S區(qū)變異檢測 提取HBV DNA后進行第1輪PCR擴增和純化，純化后的PCR產(chǎn)物進行第2輪PCR擴增與純化，最后加入10 μL去離子甲酰胺，短時振蕩溶解DNA，95 ℃變性5 min，迅速置于冰上或4 ℃冷卻4 min，隨后采用ABI 3500 Dx Genetic Analyzer基因測序儀測序。第1輪PCR反應(yīng)體系：總體積為50 μL，5×PCR buffer 10 μL（含Tris-HCl緩沖液、dNTP、Mg2+）、Taq酶3 μL、10 μmol/L上游引物與下游引物各1 μL（終濃度為200 nmol/L），DNA模板10 μL，補蒸餾水25 μL。第1輪擴增條件：尿嘧啶糖苷酸（防污染）50 ℃ 2 min；95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。第2輪PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL，DNA模板1 μL，BigDye 2 μL、BigDye Sequencing buffer 3 μL、F引物或R引物0.5 μL（終濃度為250 nmol/L），補蒸餾水13.5 μL。第2輪擴增條件：96 ℃預(yù)變性1 min；96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，25個循環(huán)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 采用Primer Primer 5.0軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸，采用BLAST分析軟件進行氨基酸序列比對。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，多組間采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗后，2個組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組一般資料比較

慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組之間年齡和HBV DNA載量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），性別及HBV基因型差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組一般資料比較

2.2 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組HBV S蛋白變異的比較

肝硬化組HBV S蛋白總體變異率明顯高于非活動性HBsAg攜帶組和慢性HBV攜帶組（P＜0.05、P＜0.01）。慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組S蛋白的MHR區(qū)域外變異率及CTL+Th免疫表位區(qū)變異率依次升高（P＜0.01）。3個組之間S蛋白的主要親水區(qū)（major hydrophilic region，MHR）及位于MHR區(qū)域內(nèi)的“a”決定簇、LOOP1和LOOP2的變異率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），MHR區(qū)域外的非免疫表位區(qū)變異率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組HBV S蛋白及MHR、MHR外變異率比較 例（%）

2.3 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組HBV S蛋白變異位點比較

慢性HBV攜帶組中有1例患者同時出現(xiàn)MHR外Th免疫表位區(qū)、CTL免疫表位區(qū)和非免疫表位區(qū)3個位點變異，1例患者出現(xiàn)MHR與MHR外Th表位2個位點變異，其他患者均為單點變異，且MHR外CTL+Th免疫表位區(qū)與非免疫表位區(qū)變異率相當(dāng)，呈隨機分布。非活動性HBsAg攜帶組有5例（13.15%）患者出現(xiàn)2個位點以上的變異，肝硬化組有9例（25.71%）患者出現(xiàn)2個位點以上的變異，且2個組的變異位點集中于MHR外CTL+Th免疫表位區(qū)。見表4。

表4 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組HBV S蛋白變異位點比較

續(xù)表4

3 討論

此前，大部分研究者認(rèn)為內(nèi)源性宿主免疫壓力與外源性免疫預(yù)防或接種（疫苗或治療）均是HBV S蛋白變異的主要原因[6]。慢性HBV攜帶者均為母親HBsAg或HBeAg陽性的圍產(chǎn)期或嬰幼兒期疫苗逃逸的HBV感染患者，該類患者均處于免疫耐受期且未接受任何抗病毒藥物治療，臨床特征為HBsAg陽性、HBeAg陽性、ALT正常、HBV DNA高載量，肝臟炎癥非常輕微，患肝硬化的概率較小[1]。本研究結(jié)果顯示，免疫耐受狀態(tài)下的慢性HBV攜帶者HBV S蛋白的變異率相對較低，MHR內(nèi)的變異主要集中于“a”決定簇中的LOOP1中，主要變異位點為126和127位點，未檢出G145R免疫逃逸位點，MHR外的變異位點呈隨機分布，CTL+Th免疫表位區(qū)與非免疫表位區(qū)變異率基本一致。經(jīng)歷免疫清除，導(dǎo)致出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換（由HBeAg陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮裕┑姆腔顒有訦BsAg攜帶者的MHR區(qū)域內(nèi)變異率與慢性HBV攜帶者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）， 其變異主要出現(xiàn)在MHR外。本研究結(jié)果與文獻報道[9-10]明顯不同。SONG等[9]的研究結(jié)果顯示，在免疫耐受期轉(zhuǎn)化為免疫清除期過程中產(chǎn)生的抗體可對HBV MHR，尤其是“a”決定簇造成強烈的選擇性壓力，從而引起該位點變異，因此HBeAg陰性患者MHR變異率高于HBeAg陽性患者。也有學(xué)者認(rèn)為，自然產(chǎn)生的變異主要集中于LOOP1區(qū)，免疫壓力導(dǎo)致的變異主要集中于LOOP2區(qū)[10]。而本研究結(jié)果顯示，免疫壓力導(dǎo)致的HBV S蛋白變異主要集中于MHR外。另外，肝硬化患者MHR外及MHR外CTL+Th免疫表位區(qū)變異率明顯升高，提示在經(jīng)歷免疫清除導(dǎo)致出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)化的過程中，免疫壓力所致的變異位點集中于MHR外，其變異與HBeAg陰性的血清學(xué)狀態(tài)有關(guān)。由于HBeAg陰性患者變異位點多出現(xiàn)于“a”決定簇外或MHR外區(qū)域，因此推測體液免疫產(chǎn)生的抗體可能并不是HBV S蛋白發(fā)生變異的主要壓力，造成HBV S蛋白變異的免疫壓力可能更多來自于CTL與Th介導(dǎo)的細(xì)胞免疫壓力。有研究結(jié)果顯示，CTL、Th介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在HBV清除過程中起關(guān)鍵作用，而體液免疫，即中和抗體產(chǎn)生相對較晚，起相對次要的作用[11]。另外，HBV變異與CHB病情加重或肝硬化具有一定的關(guān)聯(lián)性，病毒發(fā)生變異可能不僅僅是免疫壓力造成的后果。變異的HBV可能會通過免疫逃逸或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急等機制使病情加重并發(fā)展成為肝硬化。

本研究尚存在一定的不足之處：首先，非活動性HBsAg攜帶者通常被認(rèn)為預(yù)后良好，但其中有20%～30%會復(fù)發(fā)，這類患者的HBV載量通常接近或低于檢測限。由于HBV載量低于檢測限的患者無法進行DNA測序，因此本研究參考文獻[8]，選取HBV DNA＜2×103IU/mL的患者作為研究對象。其次，有研究提示有長期拉米夫定治療史的CHB患者的MHR變異率明顯高于未治療患者（χ2=5.803，P＜0.05）[12]。本研究中所有非活動性HBsAg攜帶者和肝硬化患者均有抗病毒藥物治療史，而慢性HBV攜帶者均未接受抗病毒藥物治療。本研究結(jié)果顯示，MHR變異率3個組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），不支持抗病毒治療對MHR變異產(chǎn)生影響這一結(jié)論，但抗病毒治療是否與MHR外變異有關(guān)尚無法確認(rèn)。

總之，HBV S蛋白MHR外，尤其是MHR外CTL+Th免疫表位區(qū)變異不僅與HBeAg陰性血清學(xué)狀態(tài)相關(guān)，也與肝硬化相關(guān)。