林冠 祁偉 杜生榮 林典梁 易勁松

體外受精-胚胎移植技術(shù)（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET），是重要的輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）。玻璃化冷凍作為ART 重要的輔助技術(shù)，已得到廣泛應(yīng)用。其應(yīng)用快速降溫法及冷凍保護(hù)劑，使細(xì)胞外周呈玻璃態(tài)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)不產(chǎn)生冰晶，減少了滲透壓及激冷的變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)外造成的機(jī)械損傷。配子和胚胎發(fā)育早期是表觀遺傳修飾的關(guān)鍵時(shí)期，基因印記（genomic impriting）也在此期間擦除和重建。表觀遺傳效應(yīng)在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育早期中起重要的作用，但目前尚無確切證據(jù)表明包括玻璃化冷凍在內(nèi)的技術(shù)是否對(duì)此時(shí)期的表觀遺傳修飾產(chǎn)生影響[1]。DNA 與組蛋白共同組成核小體，是染色質(zhì)的基本組成單位；組蛋白可以通過共價(jià)修飾發(fā)生甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等改變,籍此組成各式各樣的組蛋白密碼，傳遞不同的遺傳信息。就組蛋白修飾（histone modification）的形式而言，甲基化修飾是最穩(wěn)定、最具代表性的，而乙?；瘎t有較高的可變性。在表觀遺傳學(xué)修飾中，DNA 甲基化被廣泛研究，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase1，DNMT1）是催化DNA 甲基化（DNA methylation）的關(guān)鍵，其表達(dá)水平可間接反映DNA 甲基化水平。組蛋白乙酰化水平是由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）和去乙?；福╤istone deacetytransferases，HDACs）共同維持，而HATs 和HDACs 最關(guān)鍵、具代表性的酶分別是組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶GCN5（general control of nucleotide synthesis， GCN5）和組蛋白去乙?；?（histone deacetylase1， HDAC1）。GCN5 及HDAC1 均表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，不僅共同維持組蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡，也同時(shí)調(diào)控基因。胎盤被認(rèn)為是胎兒表型的主要決定因素，可作為用于分析與生長(zhǎng)和發(fā)育結(jié)果相關(guān)的印跡基因表達(dá)譜的適當(dāng)組織[1-2]。而GCN5、HDAC1 和DNMT1 可作為印跡基因的代表，故通過研究助孕妊娠婦女胎盤中上訴基因的表達(dá)情況，可以從表觀遺傳角度評(píng)估玻璃化凍融囊胚助孕技術(shù)的安全性。

1 一般資料與方法

1.1 一般資料

收集2014 年5 月—2016 年5 月間在福建省婦幼保健院以玻璃化凍融囊胚助孕妊娠并分娩的婦女50 例（觀察組）、按年齡配對(duì)選擇同期自然妊娠婦女50 例（對(duì)照組）的胎盤標(biāo)本和臨床資料。分析比較兩組孕婦的人口學(xué)資料，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＞0.05）。兩組孕婦均長(zhǎng)期留居本地，其年齡、民族、文化程度和受教育情況等均無顯著差異。本研究方案經(jīng)由福建省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論通過，經(jīng)研究對(duì)象充分知情同意并獲得患方夫妻雙方書面簽字后實(shí)施。入選標(biāo)準(zhǔn)：受孕年齡在20 ～35 歲；首次妊娠；既往身體健康無高血壓、糖尿病、血液病等病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕24 周前妊娠丟失。所有孕婦均分別記錄姓名、末次月經(jīng)、孕周、預(yù)產(chǎn)期、分娩方式、分娩孕周、妊娠合并癥、并發(fā)癥等情況。

1.2 方法

1.2.1 胎盤標(biāo)本采集 孕婦分娩后立即收集胎盤組織，仔細(xì)檢查并測(cè)量胎盤大小及重量，記錄所有相關(guān)數(shù)據(jù)。避開胎盤梗死、鈣化和血管瘤部分，從臍帶插入點(diǎn)旁開5 cm 處縱向切開胎盤組織，收集胎盤中間部位絨毛組織；存在異常臍帶植入（如帆狀胎盤）者除外。加入4%多聚甲醛固定液用于免疫組織化學(xué)分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胎盤組織中DNMT1、GCN5 和HDAC1 的表達(dá) 將組織的石蠟標(biāo)本制成3 ～5 μm 厚切片，石蠟組織切片標(biāo)本依次經(jīng)過脫蠟、沖洗、抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加封閉血清，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，分別滴加一抗和二抗，孵育、DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行100×和400×的顯微照相。結(jié)合鏡下觀察所見陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，半定量判斷結(jié)果。按以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：A為陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)：0 ～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B 為陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度分級(jí)：0（不著色，陰性）、1（淺黃色，弱陽性）、2（棕黃色，陽性）、3（棕褐色，強(qiáng)陽性）；IHS=A×B。對(duì)所有胎盤組織切片均進(jìn)行鏡下觀察，分析DNMT1、GCN5 和HDAC1 蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用 （）表示，采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，不適用χ2檢驗(yàn)者，則用Fisher 確切概率法。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤稱量結(jié)果比較

胎盤稱量結(jié)果顯示，玻璃化凍融囊胚助孕組胎盤重量、胎盤面積均顯著大于自然妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），如表1 所示。

2.2 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤DNMT1 免疫組化分析

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，兩組病例中胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞均可見DNMT1 的表達(dá)，如圖1 所示。表2 所示為兩組胎盤DNMT1的表達(dá)差異。兩組胎盤組織DNMT1 蛋白在表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度、IHS 方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

圖1 胎盤DNMT1 免疫組化染色（S-P 二步法），400×（A 玻璃化凍融囊胚助孕妊娠組；B 自然妊娠組）

2.3 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤GCN5 免疫組化分析

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，兩組樣本中胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞均可見不同程度GCN5 蛋白的表達(dá)，如圖2 所示。兩組胎盤組織GCN5 表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度、IHS 比較上均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。詳見表3。

圖2 胎盤GCN5 免疫組化染色（S-P 二步法），400×（A 玻璃化凍融囊胚助孕組；B 自然妊娠組）

表1 玻璃化凍融囊胚組與自然妊娠組胎盤稱量結(jié)果比較 （ ）

表1 玻璃化凍融囊胚組與自然妊娠組胎盤稱量結(jié)果比較 （ ）

組別 胎盤重量（g） 胎盤面積（cm2）玻璃化凍融囊胚助孕組（n=50） 792.26±242.95 870.18±364.82自然妊娠組（n=50） 642.40±111.65 743.68±208.29 t 值 3.963 2.129 P 值 ＜0.001 0.036

表2 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤組織DNMT1 表達(dá)免疫組化結(jié)果 （ ）

表2 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤組織DNMT1 表達(dá)免疫組化結(jié)果 （ ）

組別 DNMT1 表達(dá)率% DNMT1 表達(dá)強(qiáng)度 DNMT1 IHS玻璃化凍融囊胚助孕組（n=50） 22.36±5.43 1.80±0.67 43.68±25.82自然妊娠組（n=50） 22.04±5.28 1.74±0.60 41.12±22.59 t 值 0.299 0.472 0.528 P 值 0.766 0.638 0.599

表3 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤組織GCN5 表達(dá)免疫組化結(jié)果 （ ）

表3 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤組織GCN5 表達(dá)免疫組化結(jié)果 （ ）

組別 GCN5 表達(dá)率% GCN5 表達(dá)強(qiáng)度 GCN5 IHS玻璃化凍融囊胚助孕組（n=50） 18.36±5.17 1.68±0.47 33.20±15.47自然妊娠組（n=50） 18.06±4.97 1.58±0.50 30.52±15.12 t 值 0.296 1.031 0.876 P 值 0.768 0.305 0.383

表4 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組病例胎盤組織HDAC1 表達(dá)免疫組織化學(xué)分析結(jié)果 （）

表4 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組病例胎盤組織HDAC1 表達(dá)免疫組織化學(xué)分析結(jié)果 （）

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表5 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組產(chǎn)科結(jié)局比較 （ ）

表5 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組產(chǎn)科結(jié)局比較 （ ）

玻璃化凍融囊胚助孕組（n=50） 自然妊娠組（n=50） t/χ2 值 P年齡（歲） 26.44±1.94 26.20±2.25 0.571 0.569分娩孕周（周） 38.02±1.78 38.64±1.95 1.663 0.099胎兒發(fā)育早產(chǎn)兒（%） 3 （6.00） 6（12.00） - 0.487足月兒（%） 47（94.00） 44（88.00） - 0.487妊娠期并發(fā)癥 - -先兆流產(chǎn)（%） 12（24.00） 1（2.00） 10.698 0.001胎膜早破（%） 6（12.00） 5（10.00） 0.102 0.743胎位異常（%） 3（6.00） 2（4.00） - 1.000羊水過多（%） 1（2.00） 1（2.00） - 1.000妊娠期高血壓疾?。?） 1（2.00） 0 - 1.000妊娠期糖尿?。?） 3（6.00） 4（8.00） 0.083 0.773臍帶異常（%） 14（28.00） 5（10.00） 0.493 0.482胎盤早剝（%） 0 1（2.00） - 1.000產(chǎn)后出血（%） 2（4.00） 1（2.00） - 1.000妊娠合并癥 - -貧血（%） 3（6.00） 1（2.00） - 0.617甲亢（%） 0 1（2.00） - 1.000分娩方式 - -順產(chǎn)（%） 13（26.00） 36（72.00） 19.368 ＜0.001

2.4 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組胎盤HDAC1 免疫組化分析

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，兩組樣本中胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞均有HDAC1 蛋白的表達(dá)，如圖3 所示。兩組胎盤HDAC1 的表達(dá)比較見表4。兩組胎盤中HDAC1 在表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度、HIS 評(píng)分方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

圖3 胎盤HDAC1 免疫組化染色（S-P 二步法），400×（A 玻璃化凍融囊胚助孕組；B 自然妊娠組）

2.5 玻璃化凍融囊胚助孕組與自然妊娠組產(chǎn)科結(jié)局比較

觀察組及對(duì)照組產(chǎn)科結(jié)局比較結(jié)果表5 所示：玻璃化凍融囊胚助孕組先兆流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)、剖宮產(chǎn)率均高于自然妊娠組（P ＜0.05）；而其在分娩孕周、早產(chǎn)率、妊娠期并發(fā)癥、妊娠合并癥、分娩方式的組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

3 討論

表觀遺傳學(xué)屬于研究細(xì)胞調(diào)控基因表達(dá)的一門學(xué)科，其研究基因在其遺傳密碼或核苷酸序列不改變的狀態(tài)下表達(dá)可遺傳的變異的機(jī)制[3]。目前已了解的表觀遺傳現(xiàn)象包括有基因組印記[4]、DNA 甲基化、組蛋白修飾、基因沉默（gene silencing）、休眠轉(zhuǎn)座子激活等?；蚪M印記指來自精子和卵子的等位基因在形成合子細(xì)胞后進(jìn)行通過修飾、使得子代的等位基因只單獨(dú)表達(dá)父系或母系的遺傳信息的現(xiàn)象，以DNA 甲基化最為常見。原始生殖細(xì)胞早期分化中，通過等位基因的甲基化，大部分表觀遺傳信息被刪除，然后合子的基因組開始進(jìn)行第一輪表觀遺傳重編程[4-5]。若印記基因改變發(fā)生在配子形成和植入前生長(zhǎng)發(fā)育階段，可破壞正常的生長(zhǎng)和發(fā)育，導(dǎo)致印記基因表達(dá)異常，常引起眾多伴隨有突變和表型缺陷的疾病[6-7]。人工輔助生殖技術(shù)使得配子形成的場(chǎng)所轉(zhuǎn)到了人工構(gòu)建的環(huán)境下，有研究認(rèn)為不同的培養(yǎng)環(huán)境和操縱技術(shù)對(duì)印記基因表達(dá)有影響，可能導(dǎo)致此階段的錯(cuò)誤隨機(jī)發(fā)生[6-8]。玻璃化冷凍技術(shù)使用高濃度的乙二醇（EG）等冷凍保護(hù)劑以達(dá)到快速、不結(jié)冰晶、減少細(xì)胞損傷風(fēng)險(xiǎn)的效果；但有報(bào)道可使參與表觀修飾的關(guān)鍵蛋白酶（如Dnmt3等）表達(dá)下降，可能會(huì)影響組蛋白修飾及DNA 甲基化狀態(tài)，影響表觀遺傳修飾，從而引起表觀遺傳的改變[9-10]。

胎盤是印記基因表達(dá)的主要器官之一[11]，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞能否正常發(fā)育、分化直接影響著胎盤的生長(zhǎng)及功能。而印跡基因的異?；蚩捎绊懱ケP結(jié)構(gòu)，影響胚胎的發(fā)育，造成胎源性疾病的產(chǎn)生。有研究通過動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)輔助生殖可影響胎盤發(fā)育及其功能，致胎盤效率下降，進(jìn)而影響胎兒宮內(nèi)發(fā)育及出生體質(zhì)量;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，輔助生殖操作可通過干擾早期胚胎表觀印跡影響胎盤發(fā)育及功能，進(jìn)而影響胎兒發(fā)育及出生體質(zhì)量[12]。本研究通過比較兩組胎盤組織中DNMT1，GCN5 和HDAC1 蛋白在表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度、IHS 評(píng)分的不同，發(fā)現(xiàn)其均無顯著性差異，提示玻璃化凍融操作未對(duì)上述與表觀修飾相關(guān)酶的表達(dá)產(chǎn)生影響，間接說明該項(xiàng)助孕技術(shù)所構(gòu)建的胚胎與自然受孕的胚胎無明顯的表觀遺傳學(xué)差異。表觀遺傳修飾依賴于各種蛋白酶與相關(guān)蛋白結(jié)合，而慢速冷凍形成的冰晶可能影響蛋白質(zhì)活性，進(jìn)而影響基因編輯過程。玻璃化冷凍抑制細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，并防止?jié)B透性休克，從而減少對(duì)活細(xì)胞及蛋白質(zhì)的損害，在不改變表觀遺傳修飾的情況下，能提高卵母細(xì)胞復(fù)蘇后的成功率[13]。但本研究只對(duì)以上三種表觀遺傳修飾相關(guān)蛋白酶進(jìn)行了分析，為全面評(píng)估玻璃化凍融囊胚的表觀遺傳基因表達(dá)，有待于擴(kuò)展基因種類、擴(kuò)大樣本例數(shù)以進(jìn)一步研究。

本研究顯示玻璃化凍融囊胚助孕組胎盤重量和面積大于自然受孕組，這與國內(nèi)外主流研究結(jié)果相符[14-15]。本研究又分別對(duì)觀察組與對(duì)照組的一些產(chǎn)科結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示觀察組先兆流產(chǎn)發(fā)生率、剖宮產(chǎn)率均較對(duì)照組顯著升高（P ＜0.05），而其他觀察指標(biāo)比較均無差異。流產(chǎn)原因多種多樣，其與包括DNA 甲基化在內(nèi)的表觀遺傳修飾所導(dǎo)致的胚胎不健全、胎盤形成異常是否有關(guān)目前尚無定論；而在人口基數(shù)大的我國，出于多種考量，輔助生殖受孕本身即是剖宮產(chǎn)指征，故不能單憑以上兩率升高而否定輔助生殖技術(shù)。國內(nèi)喬杰院士團(tuán)隊(duì)[16]的一項(xiàng)薈萃分析通過分析快速冷凍程序?qū)ε咛ゴ婊盥?、成熟率、受精率等和臨床風(fēng)險(xiǎn)率的風(fēng)險(xiǎn)比，也認(rèn)為與新鮮和慢速冷凍程序相比，成熟卵母細(xì)胞和胚胎的玻璃化獲得了更好的臨床結(jié)果，且沒有增加DNA損傷、基因組印記、和胚胎非整倍性的風(fēng)險(xiǎn)。賀麗人等[17]也回顧分析1 237 例接受ART 成功妊娠和5 040 例自然受孕的圍產(chǎn)結(jié)局，結(jié)果顯示ART 組的剖宮產(chǎn)率、多胎妊娠率、前置胎盤、妊娠期高血壓、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、產(chǎn)后出血、早產(chǎn)和低出生體質(zhì)量率等均顯著高于自然受孕組。這些研究的部分結(jié)論也與此次研究結(jié)果一致，即玻璃化凍融囊胚助孕是一項(xiàng)安全的人工輔助生殖技術(shù)，可獲得與自然妊娠相似的妊娠結(jié)局。但本研究時(shí)限較短，納入樣本量有限，亦有待于擴(kuò)大樣本容量、延長(zhǎng)研究周期以進(jìn)一步印證。

綜上，玻璃化凍融囊胚助孕技術(shù)不改變胎盤中GCN5，HDAC1 和DNMT1 的表達(dá)，且不增加妊娠期產(chǎn)科主要并發(fā)癥及圍產(chǎn)兒風(fēng)險(xiǎn)；但有可能與先兆流產(chǎn)和剖宮產(chǎn)的發(fā)生率增加有關(guān)。在目前，該技術(shù)是一種安全有效的助孕技術(shù)。