崔云鵬，潘元星，林云飛，米川，王冰，施學東

0 引言

外被體包被蛋白β2亞基（coatomer protein complex subunit beta 2,COPB2）參與構成外被體包被蛋白復合體I，主要負責細胞內(nèi)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間的囊泡轉運[1-2]。在保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的完整性，維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)COPB2除了參與囊泡運輸外，COPB2還與細胞周期調(diào)控[3]、細胞凋亡[4-5]密切相關，并且還參與多條細胞信號通路轉導[6-9]。近年來多項研究顯示，COPB2基因在上皮來源癌細胞中呈高表達，并能夠通過不同分子調(diào)控機制及信號通路影響細胞周期、凋亡，從而促進癌細胞異常增殖，并且COPB2的表達水平與患者預后相關，COPB2高表達患者預后較差[4,8-10]。COPB2在上皮來源惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

COPB2在人骨肉瘤細胞中的表達水平、在人骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用，尚無文獻報道。為探討COPB2對人骨肉瘤細胞的分子調(diào)控機制，本研究首先檢測COPB2在人骨肉瘤細胞系中的表達情況，進一步基于IPA軟件（ingenuity pathway analysis）的生物信息學分析，探析COPB2對人骨肉瘤細胞可能的分子調(diào)控機制，為后續(xù)進一步研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 RT-qPCR檢測COPB2在人骨肉瘤細胞系中的表達水平

人骨肉瘤細胞系U-2OS、MG-63、HOS購自上海吉凱基因化學技術有限公司，Saos-2購自中科院。以2×104/ml密度制成細胞懸液，接種于6孔板，每種細胞設3個復孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長達80%時收集細胞，應用TRIzol法進行總RNA提取，RNA反轉錄后行RT-qPCR檢測（SYBR Master Mixture，TAKARA）。選用GADPH為內(nèi)參，GAPDH：上游5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’；COPB2：上游-5’GTGGGGACAAGCCATACCTC-3’，下游5’-GTGCTCTCAAGCCGGTAGG-3’。測定ΔCt值，當ΔCt值≤12時，該細胞中基因為高豐度表達。

1.2 應用RNAi技術下調(diào)U-2OS細胞COPB2表達

人骨肉瘤細胞系U-2OS，以培養(yǎng)基按2×104個每毫升密度制成細胞懸液，接種于6孔板中培養(yǎng)。細胞分為COPB2沉默組（knock down,KD）和對照組（normal control,NC），每組設3個復孔。定期更換培養(yǎng)基，待細胞密度達到2×104個每毫升時，更換綠色熒光蛋白慢病毒培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)（KD組慢病毒含COPB2沉默序列：LVPGCSIL-004PSC3634-2；NC組不含COPB2沉默序列：psc3741。慢病毒由上海吉凱基因技術有限公司提供），感染復數(shù)10:1。感染后16 h更換普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，感染后72 h收集細胞在熒光顯微鏡下觀察并應用RT-qPCR檢測COPB2基因沉默效率。COPB2和GADPH上下游引物序列同上。應用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 人基因表達譜分析

收集KD和NC組細胞，采用TRIzol法進行總RNA抽提，抽提所得總RNA經(jīng)NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100質(zhì)檢（質(zhì)控標準：NanoDrop 2000-1.7＜A260/A280＜2.2；Agilent 2100 Bioanalyzer-RIN≥7.0，并且28S/18S＞0.7）。應用體外反轉錄試劑盒（GeneChip 3’IVT Express Kit，Affymetrix）制備帶生物素標志的aRNA（amplified RNA）。將aRNA進行純化，然后將其片段化后與芯片探針雜交。應用人基因表達譜芯片（GeneChip PrimeView human,Affymetrix）對兩組細胞進行基因表達譜檢測，基因表現(xiàn)有顯著差異的篩選標準為：倍數(shù)變化在1.5倍以上（|倍數(shù)變化/FC|＞1.5），并且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

1.4 IPA分析

將得到的基因表達譜分析結果輸入在線整合分析軟件—IPA軟件系統(tǒng)（http://www.ingenuity.com/）進行分析[11]。

1.4.1 經(jīng)典通路分析 首先基于差異基因列表與各個通路包含的基因集合，通過計算顯著性（P＜0.05）來找到表達差異基因主要富集在哪些通路中；接下來基于差異基因受調(diào)控信息（上調(diào)/下調(diào)）并與文獻記載的調(diào)控信息相比較（|Z|＞2），明確調(diào)控通路。

1.4.2 疾病功能分析 基于數(shù)據(jù)庫（Ingenuity Knowledge Base），分析差異基因在不同疾病與功能分類中的富集情況（P＜0.05，|Z|＞2）。

1.4.3 互作網(wǎng)絡分析 對每一個調(diào)控網(wǎng)絡進行打分，該分值檢測了同一個網(wǎng)絡中差異基因的數(shù)量，同一個網(wǎng)絡中包含實驗差異基因的數(shù)量越多，得分則越高。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，計量資料均采用均值±標準差（）表示。兩組數(shù)據(jù)比較前采用Shapiro-Wilk法進行正態(tài)性檢驗，Levene檢驗方法進行方差齊性檢驗，滿足條件時采用獨立樣本t檢驗；不滿足條件時采用Wilcoxon符號秩和檢驗。生物信息分析統(tǒng)計由IPA軟件實現(xiàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，|Z評分|＞2視為COPB2對差異基因的調(diào)控有意義。

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測COPB2在人骨肉瘤細胞系中的表達水平

RT-qPCR結果顯示COPB2在人骨肉瘤細胞系U-2OS、MG-63、HOS和Saos-2中表達豐度均較高，見圖1。ΔCt值分別為7.08±0.10、4.88±0.40、5.38±0.20和4.51±0.03。

圖1 RT-qPCR檢測COPB2表達情況Figure 1 COPB2 expression detected by RT-qPCR

2.2 慢病毒感染U-2OS細胞及COPB2基因沉默效率

KD組和NC組U-2OS細胞在慢病毒感染后均貼壁成團生長，細胞形態(tài)呈不規(guī)則三角形或長梭形。熒光顯微鏡顯示大部分細胞表達綠色熒光蛋白，提示慢病毒感染效率較高，見圖2A～2D。RT-qPCR結果顯示KD組COPB2 mRNA表達水平為NC組的14.8%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001），見圖2E。

2.3 人基因表達譜分析結果

KD組COPB2表達水平較NC組下降4.0倍（FC=-4.0）。兩組相比，1393個基因表達出現(xiàn)顯著差異，其中上調(diào)基因數(shù)831個，下調(diào)基因數(shù)562個，見圖3。

2.4 經(jīng)典通路分析

經(jīng)典通路分析結果顯示，在已知的400條經(jīng)典通路中，150條轉導通路中差異基因富集達到顯著水平（P＜0.05），其中3條轉導通路|Z|＞2，這三條通路及其富集的差異基因包括凝血栓蛋白1（thrombospondin 1,TSP1）抑制血管形成通路、急性期反應通路、細胞周期蛋白和細胞周期調(diào)控通路，見表1。

2.5 疾病功能分析

疾病功能分析結果顯示，被激活的功能主要集中在惡性腫瘤、機體損傷與異常、細胞運動中，與細胞瘤變、腫瘤細胞侵襲和細胞侵襲相關。被抑制的功能主要集中在細胞生存與死亡、機體損傷與異常中，與細胞失巢凋亡、機體死亡和器官退變相關，見表2。疾病功能分析結果顯示COPB2基因與骨肉瘤細胞瘤變、侵襲力和失巢凋亡等功能相關。

圖2 慢病毒感染沉默COPB2基因Figure 2 COBP2 gene was silenced by lentiviral

圖3 人基因表達譜分析結果Figure 3 Human gene expression profiling results

2.6 互作網(wǎng)絡分析

互作網(wǎng)絡分析結果顯示差異基因的生物功能主要集中在惡性腫瘤、細胞周期和機體損傷與異常。差異基因包括ACSL3、AFF4、Alpha tubulin、ANKRD28、ANKRD37、BAG2、Beta Tubulin、CBLB、CCT5、DISC1、DNM3、DPCD、Dynamin、FKBP5、GSE1、HMG20A、ITSN1、LZTFL1、MED12、mediator、NDRG1、p85（pik3r）、PINK1、PPP4R3B、PPP6C、RPAP3、SCOC、SMARCC1、Spectrin、SYBU、TAB2、TCP1、TGFBR2、TNKS、TTC8，該網(wǎng)絡得分35分。

3 討論

骨肉瘤是一種由間充質(zhì)干細胞或骨母細胞染色體異位、基因突變、細胞異常分化導致的高度惡性腫瘤，最常見于兒童和青少年[12]。手術聯(lián)合化療仍是骨肉瘤治療的標準治療方案，但局限性骨肉瘤患者5年生存率不超過70%，且出現(xiàn)肺轉移后僅15%～30%，治療效果差強人意[13]。特別是對于化療藥物反應不佳的骨肉瘤患者，目前臨床缺乏行之有效的治療手段[14]。究其原因，在于骨肉瘤的分子發(fā)病機制尚不明確。因此，對骨肉瘤發(fā)病機制的深入研究和新的精準治療靶點的尋找極為重要。

本研究基于IPA生物信息學分析，對COPB2在人骨肉瘤中的可能作用和作用機制進行探析。結果顯示COPB2在人骨肉瘤細胞系中呈高表達，可能通過TSP1抑制血管形成通路、急性期反應通路、細胞周期蛋白和細胞周期調(diào)控通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，并對骨肉瘤細胞侵襲能力、增殖凋亡發(fā)揮調(diào)控作用。

IPA經(jīng)典通路分析結果顯示，三條通路被顯著激活或抑制。TSP1是一種糖蛋白，來源于血小板的α顆粒，通過與CD47結合在止血和血管形成過程中發(fā)揮重要作用[15]。急性期反應是機體對外界刺激所作出的應激反應，表現(xiàn)為體內(nèi)某種特殊分子濃度的改變，激發(fā)機體的特定功能，而細胞周期調(diào)控則維持著組織器官的正常功能及損傷修復。上述三個信號通路中，細胞周期調(diào)控通路與惡性腫瘤最為相關。細胞增殖異常與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展關系密切。Cheng等[16]研究顯示細胞周期調(diào)控蛋白在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起到關鍵作用，作為骨肉瘤治療的藥物靶點，有著較好的研究前景。細胞周期調(diào)控蛋白中，以cyclinD1（CCND1）、p21（CDKN1A）、cyclinD2（CCND2）和cyclinE2（CCNE2）與骨肉瘤關系密切，cyclinD1、cyclinD2和cyclinE2是G1期的主要調(diào)控蛋白，異常表達后會導致細胞周期G1期縮短，大量細胞進入S期，細胞增殖異常，已被證實與乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤相關[17-18]。此外p21被證實在骨肉瘤腫瘤組織中的表達水平高于癌旁組織[19]。

表1 經(jīng)典通路分析Table 1 Classic pathway analysis

表2 疾病功能分析Table 2 Disease function analysis

COPB2作為外被體包被蛋白復合體Ⅰ的7個亞基之一，對細胞周期也具有一定的調(diào)控作用。COPB2能夠輔助鋅指X連接蛋白向細胞核內(nèi)轉運，促進rDNA轉錄，調(diào)控細胞增殖[3]。在惡性腫瘤領域，Wang等[6]以結腸癌細胞系為研究對象，應用慢病毒介導RNAi技術沉默COPB2表達，COPB2沉默組細胞增殖能力和細胞克隆能力下降，進一步發(fā)現(xiàn)COPB2沉默后p16和p21表達水平升高，從而cyclinA1和cyclinA2表達水平降低。研究結果提示COPB2基因能夠通過調(diào)節(jié)cyclinA1、cyclinA2，對細胞周期發(fā)揮調(diào)控作用。因此，COPB2表達異常能夠?qū)毎芷谡{(diào)控產(chǎn)生影響，促進惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，COPB2在人骨肉瘤細胞系U-2OS、MG-63、HOS和Saos-2中高表達，可能通過細胞周期蛋白和細胞周期調(diào)控通路參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，COPB2與骨肉瘤細胞瘤變、侵襲力和失巢凋亡相關。