樊大貝，李志臻，張好好

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南鄭州 450052）

X連鎖的先天性腎上腺發(fā)育不良（adrenal hypo plasia congenital，AHC）是一種罕見的X染色體隱性遺傳病，主要是由腎上腺功能不全引起，大多數(shù)為男性病例，只有極少數(shù)的女性病例，發(fā)病率在1∶140 000至1∶2 000 000，但是目前國(guó)內(nèi)沒有確切的關(guān)于該疾病發(fā)病率的數(shù)據(jù)報(bào)道［1－2］。此類疾病患者通常會(huì)在嬰兒早期或者整個(gè)兒童時(shí)期表現(xiàn)出腎上腺功能不全的癥狀。一般情況下，該疾病的治療方法包括終身使用糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素替代療法［3－4］。

許多AHC病例是由遺傳因素引起的，主要包括常染色體隱性遺傳或者X連鎖隱性遺傳。劑量敏感－性逆轉(zhuǎn)－腎上腺增生不良基因1（dosage sensitive sex－reversal，adrenal hypoplasia locus on the X－chro mosome，gene 1，DAX－1）位于X染色體上，含有兩個(gè)外顯子。DAX－1基因的特定突變，包括點(diǎn)突變和缺失突變會(huì)引發(fā)腎上腺發(fā)育不良，因此，DAX－1被認(rèn)為是腎上腺發(fā)育的重要角色。DAX－1也是非典型孤兒核受體超家族的一員，與此同時(shí)，DAX－1作為主要的負(fù)調(diào)節(jié)劑與其他核受體相互作用［5］。目前已有超過200種DAX－1突變位點(diǎn)被報(bào)道，突變方式多樣，以片段缺失、移碼突變、無義突變和錯(cuò)義突變?yōu)橹鳌Ｏ嚓P(guān)研究表明，DAX－1序列突變可以引起男女之間的性別反轉(zhuǎn)表型，也可以導(dǎo)致性腺機(jī)能減退，這凸顯了DAX－1基因在性別決定和性腺發(fā)育方面的關(guān)鍵作用［6－7］。目前對(duì)于AHC發(fā)病機(jī)制的相關(guān)科學(xué)認(rèn)知上仍然表現(xiàn)不足，因此仍然無法實(shí)現(xiàn)有效的AHC藥物治療體系。本文主要通過搜集到鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的5歲男性AHC先證患者的家系，分析患者及家系成員臨床特征、基因型及二者之前的關(guān)系，以增加對(duì)AHC的認(rèn)知，提高對(duì)AHC的診斷和治療水平。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象2018年鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院診斷為X連鎖先天性AHC的5歲先證者及家系成員。本研究經(jīng)過鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)并征得患兒父母的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1病歷資料收集 收集先證者及家系成員的發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)、體格檢查（包括皮膚和外生殖器）、家族史及既往病史、生長(zhǎng)發(fā)育及治療情況。

1.2.2激素測(cè)定 采用化學(xué)免疫發(fā)光法檢測(cè)先證者促腎上腺皮質(zhì)激素、腎素、皮質(zhì)醇、醛固酮、睪酮、黃體生成素、卵泡刺激素。采用放射免疫法檢測(cè)患者17－羥孕酮。此外，通過超聲影像對(duì)先證者的腎上腺及性腺進(jìn)行相關(guān)檢查。

1.2.3基因檢測(cè) 首先，采集先證者、父母及其家系成員的外周血約4 mL（管中預(yù)先已加入EDTA抗凝血），通過 QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，Germa ny）對(duì)血液基因組DNA進(jìn)行提取，將提取后的DNA放于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Premier Primer 5 0軟件設(shè)計(jì)DAX－1基因引物，送由上海生工生物進(jìn)行合成。PCR反應(yīng)體系為20 L，具體體系如下：基因組DNA 2 L、10反應(yīng)緩沖液2 L、DNA聚合酶 0 3 L、dNTP 2 L、上游引物 0 5 L、下游引物0 5 L，其余用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，共28個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)后，72℃終延伸5 min，8℃冷卻保存。經(jīng)過擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

進(jìn)一步將DNA進(jìn)行片段化并進(jìn)行DNA建庫(kù)，通過對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行捕獲后經(jīng)過Illumina Hiseq高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，其中測(cè)序讀長(zhǎng)為2 150 bp。測(cè)序原始數(shù)據(jù)根據(jù)SamTool和Pindel軟件進(jìn)行分析，并且與UCSC Genomics數(shù)據(jù)庫(kù)提供的人類基因組hg19參考序列進(jìn)行比對(duì)，嚴(yán)格評(píng)估目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度及對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)DAX－1序列變異進(jìn)行過濾并且篩選出潛在的突變位點(diǎn)，通過Sanger測(cè)序驗(yàn)證這些潛在的突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 先證者臨床資料先證者，男，5歲，因“自幼精神萎靡”為代訴于2018年5月27日就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院。該患者自出生被發(fā)現(xiàn)全身皮膚呈暗黑色，無明顯其他異常表現(xiàn)，系第一胎第一產(chǎn)，40周剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量為3 65 kg，患兒父母否認(rèn)近親結(jié)婚及家族存在類似疾病史，患兒母親否認(rèn)孕期有特殊用藥史及毒物接觸史。隨后在3個(gè)月大時(shí)出現(xiàn)體質(zhì)量不增、嘔吐等現(xiàn)象，曾于鄭州市兒童醫(yī)院就診，經(jīng)治療電解質(zhì)正常后出院。入院前父母自述患者出現(xiàn)惡心、嘔吐現(xiàn)象。入院后查體：身長(zhǎng)90 cm，體質(zhì)量26 kg，體溫37 1℃，脈搏每分鐘153次，呼吸每分鐘38次，血壓75／36 mm Hg?；颊咭庾R(shí)清晰，精神萎靡，全身皮膚色素沉著，心、肺、腹及神經(jīng)系統(tǒng)查體均未見明顯異常。外生殖器未見明顯畸形，陰囊皮膚色素沉著。電解質(zhì)：鉀為 6 42 mmol· L－1，鈉為 116 5 mmol·L－1，氯為75 3 mmol·L－1。血?dú)夥治觯簆H為 7 22，二氧化碳分壓值為 7 9 kPa，氧分壓值為 10 3 kPa，HCO3－值為17 8 mmol·L－1。激素水平檢測(cè)：促腎上腺皮質(zhì)激素為759 3 ng·L－1，腎素活性為每小時(shí) 0 97 ng·mL－1，皮質(zhì)醇為 25 6 g·L－1，醛固酮為 35 3 ng·L－1，硫酸脫氫表雄酮為 14 2 mg·L－1，睪酮為 3 39 g·L－1，孕酮為 0 31 g·L－1，17－羥孕酮為6 7 g·L－1。肝腎功能正常，甲狀腺功能正常，尿、便常規(guī)正常。彩超結(jié)果顯示：肝臟、胰腺、脾臟、腎臟、睪丸均未見異常。

2.2 基因結(jié)果該例先證者DAX－1基因檢測(cè)結(jié)果顯示，外顯子I存在突變：c 214G＞C，該突變未見文獻(xiàn)報(bào)道。其母親為該突變攜帶者，父親并未檢測(cè)到該突變，此突變?yōu)殄e(cuò)義突變，即導(dǎo)致DAX－1基因中編碼的第72位氨基酸發(fā)生改變，由天冬氨酸（D）突變成組氨酸（H）。使用PolyPhen－2進(jìn)行蛋白質(zhì)損傷分析以預(yù)測(cè)該突變位點(diǎn)對(duì)蛋白的影響，結(jié)果顯示該突變對(duì)蛋白功能會(huì)產(chǎn)生有害作用（圖1）。該基因突變最終導(dǎo)致編碼成無功能或者功能異常的DAX－1蛋白。

圖1 突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)損傷預(yù)測(cè)

2.3 激素治療患者自入院后病情發(fā)展較不穩(wěn)定，給予氫化可的松進(jìn)行對(duì)癥治療，治療1個(gè)月后病情穩(wěn)定，隨后進(jìn)行復(fù)查檢測(cè)激素水平發(fā)現(xiàn)：促腎上腺皮質(zhì)激素為368 3 ng·L－1，皮質(zhì)醇為 16 7 g·L－1，醛固酮為35 3 ng·L－1，硫酸脫氫表雄酮為 103 2 g·L－1，睪酮為0 33 g·L－1，孕酮為 0 01 g·L－1，17－羥孕酮為0 6 g·L－1。電解質(zhì)、血常規(guī)均正常，予以院外繼續(xù)口服氫化可的松（8 mg，每日3次）和氟氫可的松（早0 05 mg，晚0 05 mg）替代治療，3個(gè)月后復(fù)診，未再發(fā)現(xiàn)患者有復(fù)發(fā)的癥狀，生長(zhǎng)發(fā)育良好。

3 討論

DAX－1基因主要在下丘腦－垂體－腎上腺－性腺中表達(dá)，因此其對(duì)于下丘腦、垂體、腎上腺和性腺的正常發(fā)育與功能起著十分重要的作用［8］。AHC臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜，大多在嬰幼兒階段發(fā)病，且多伴有體質(zhì)量變化、嘔吐、腹瀉、全身皮膚色素沉著等相關(guān)臨床表現(xiàn)。此外，也存在嚴(yán)重的高鉀、低鈉和酸中毒的現(xiàn)象。目前已經(jīng)報(bào)道的DAX－1基因突變類型已經(jīng)達(dá)到200多種，包括了移碼突變、片段缺失或重組、無義突變、錯(cuò)義突變等，報(bào)道最多的是移碼突變或無義突變，導(dǎo)致DAX－1基因編碼區(qū)異常，影響蛋白編碼，但是DAX－1基因突變導(dǎo)致AHC引發(fā)的臨床表現(xiàn)機(jī)制尚不清楚［9－11］。因此，分子診斷技術(shù)的發(fā)展為通過基因檢測(cè)手段診斷AHC提供了新的可靠手段。通常情況下，患者早期臨床表現(xiàn)與醛固酮減少癥、21－羥化酶缺乏癥、Addison病臨床表現(xiàn)相似，因此容易被誤診。Wang等［12］報(bào)道發(fā)現(xiàn)8歲男孩因?yàn)楦篂a、嘔吐、皮膚色素沉著進(jìn)行就診，經(jīng)過檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)高鉀、低鈉、促腎上腺皮質(zhì)激素水平升高，17－羥孕酮正常，因此診斷為Addison病，直到12歲時(shí)因?yàn)榛颊咝韵侔l(fā)育不良后重新就診，經(jīng)過基因檢測(cè)診斷發(fā)現(xiàn)DAX－1基因突變，最終確診為AHC。本病例中的先證者為5歲男童，表現(xiàn)為全身皮膚色素沉著、惡心、嘔吐、體質(zhì)量減輕等現(xiàn)象，而且促腎上腺皮質(zhì)激素水平明顯提高，提示該患者存在腎上腺皮質(zhì)功能不全，但是該臨床癥狀容易被誤診為其他疾病，因此需要采用嚴(yán)格的基因檢測(cè)。本研究中，該患兒DAX－1經(jīng)過基因檢測(cè)后存在移碼突變，其父無此基因突變位點(diǎn)，其母為此基因突變攜帶者，因此綜合考慮判斷為X連鎖的AHC疾病。本研究提示，在臨床上，對(duì)于此類患者應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎診斷，必要時(shí)需結(jié)合基因檢測(cè)確認(rèn)疾病類型，避免誤診。該基因突變的發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)一步豐富人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，為AHC的分子診斷提供了新的基因突變位點(diǎn)。

AHC同樣也會(huì)表現(xiàn)為青春期前的腎上腺皮質(zhì)功能不全現(xiàn)象，這會(huì)導(dǎo)致青春期過程的性腺發(fā)育不良和成年后的生精障礙［13］。本實(shí)驗(yàn)的患者目前仍然處于青春期前，尚未合并性腺發(fā)育不良，因此不能夠準(zhǔn)確評(píng)估未來生長(zhǎng)發(fā)育過程中性腺發(fā)育情況。因此應(yīng)提供后續(xù)的隨訪工作和干預(yù)治療，減輕患者及家庭由于疾病帶來的經(jīng)濟(jì)、心理負(fù)擔(dān)。腎上腺皮質(zhì)功能發(fā)育不全若不及時(shí)治療，會(huì)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的并發(fā)癥，如低鈉、高鉀血癥、酸中毒等，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)＜吧?4］。本實(shí)驗(yàn)的患者就診后通過外源性的氫化可的松和氟氫可的松替代治療，病情得到逐步好轉(zhuǎn)。但是，眾所周知，糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素替代療法是需要終身服用的。因此，后續(xù)的治療需要規(guī)律性的隨診復(fù)查并根據(jù)患者情況及時(shí)調(diào)整診療方案。

綜上，我們鑒定了1例由于DAX－1基因突變導(dǎo)致的AHC家系，并且利用外源性氫化可的松進(jìn)行治療和干預(yù)。此外，DAX－1突變導(dǎo)致的臨床癥狀由于與其他疾病癥狀相似，容易被誤診。因此，當(dāng)患者就診時(shí)，需要綜合考慮臨床癥狀，并且盡量盡早進(jìn)行基因檢測(cè)以確定疾病類型。此外，要做到盡早治療、規(guī)律復(fù)查、合理調(diào)整治療方案等原則。