楊 翠，李敬東，字友梅，高攀科，韓效林

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，河南 衛(wèi)輝 453100)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種造血干/祖細(xì)胞的異質(zhì)性惡性克隆性疾病，是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。白血病的形成是一個(gè)復(fù)雜、多步驟的過程，基因組異常在AML的發(fā)生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，這種異常包括染色體異位、基因突變等，其可形成具有腫瘤特征的融合基因參與AML的發(fā)生、發(fā)展、診斷及預(yù)后[1]。目前這種基因組學(xué)可用于AML的診斷、分型、療效監(jiān)測和預(yù)后評估等。因此，本研究通過回顧性分析，收集本院196例初診原發(fā)AML患者的臨床資料，細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)，免疫分型，融合基因及5種常見基因突變[FMS樣酪氨酸激酶3-內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(fms-like tyrosine kinase 3-internal tandem duplication, FLT3-ITD)、脫氧核糖核酸甲基轉(zhuǎn)移酶3A(deoxyribonucleic acid methytransferase 3A, DNMT3A)、核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin gene 1,NPM1)、CCAAT/增強(qiáng)結(jié)合蛋白A(CCAAT/enhancer binding protein A,CEBPA)、C-KIT基因突變]，旨在探討河南豫北地區(qū)AML患者的臨床病理特征。

1 資料與方法

1.1 臨床資料入組我院2013年1月至2018年12月收治的臨床資料完整的初診原發(fā)AML患者為研究對象，均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等檢查證實(shí)符合AML的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除骨髓增生異常綜合征、骨髓增殖性腫瘤、慢性粒細(xì)胞白血病等轉(zhuǎn)變的AML。共篩選出符合條件的患者196例，均為河南豫北地區(qū)戶籍，入住我院前未接受任何抗白血病治療。196例患者中，男109例、女87例，初診年齡18～85歲，根據(jù)患者年齡分為老年組(≥60歲，75例)、青年組(<60歲，121例)。

1.2 主要試劑和儀器Trizol購自美國Gibcol-BRL公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自北京賽奧吉諾生物科技有限公司，PTC-200聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)儀、371型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，CK40型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查取患者骨髓液制作成涂片，干燥后進(jìn)行瑞氏染色和組織化學(xué)染色，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 免疫學(xué)檢查抽取患者骨髓液2 mL，經(jīng)肝素抗凝后，制備成單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞懸液，通過熒光標(biāo)記的單克隆抗體和流式細(xì)胞儀檢測分析白血病細(xì)胞的表面抗原，陽性細(xì)胞數(shù)以幼稚細(xì)胞抗原在細(xì)胞總數(shù)中的表達(dá)比例表示；陽性表達(dá)定義為細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞總數(shù)中的表達(dá)百分比≥10%，細(xì)胞膜抗原表達(dá)百分比≥20%，比對抗原表達(dá)陽性率進(jìn)行計(jì)算[3]。

1.5 融合基因檢測抽取患者骨髓液2～3 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀抗凝后，Trizol提取有核細(xì)胞RNA，通過多巢式PCR檢測AML的43種融合基因，分別為：NUP98-HoxD13、NPM-ALK、TCF3-HLF、ETV6/PDGFRA、FLP1L1-RARa、STAT5b-RARa、BCR-ABL1、PML-RARa、AML1-ETO、NUP98-HoxC11、NUP98-HoxA13、NUP98-HoxA11、TEL-JAK2、CBFβ-MYH11、PLZF-RARa、FLP1L1-PDGFRA、DEK-CAN、AML1-MDS1/EV11、AML1-MTG16、E2A-PBX1、NPM-MLF、MLL-AF9、MLL-AF10、NUMA1-RARa、PRKAR1A-RARa、NUP98-PMX1、MLL-AFX、MLL-ENL、MLL-AF17、MLL-AF1p、MLL-AF1q、MLL-ELL、MTT-SEPT6、MLL-AF6、MLL-AF4、NPM-RARa、SIL-TAL1、SET-CAN、TEL-AML1、TEL-PDGFRB、TLS-ERG、TEL-ABL1、NUP98-HoxA9。

1.6 基因突變檢測抽取患者骨髓液2～3 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀抗凝后，送檢鄭州金域檢驗(yàn)公司，通過一代或二代基因測序的方法檢測DNMT3、FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、C-KIT等5種常見AML突變基因。

2 結(jié)果

2.1 2組外周血指標(biāo)及骨髓原始細(xì)胞比例的比較老年組患者外周血紅細(xì)胞、血紅蛋白及血小板水平均較青年組患者顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；2組患者外周血白細(xì)胞和骨髓原始細(xì)胞比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>005)。見表1。

表1 2組外周血指標(biāo)及骨髓原始細(xì)胞比例的比較

2.2 2組免疫分型結(jié)果比較FAB分型顯示：老年組患者以M2型為主，青年組患者以M3型為主，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 2組免疫分型結(jié)果比較 n(%)

2.3 2組融合基因分析結(jié)果比較196例患者中共有72例檢測出融合基因，檢出率為36.7%，未檢測到攜帶≥2種融合基因者，檢出的融合基因分別為AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11、BCR-ABL1、MLL-AF9、NUP98-HoxA9。2組患者各種融合基因檢測結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

2.4 2組基因突變分析結(jié)果比較196例患者5種基因突變總檢出率為37.2%。老年組患者DNMT3A突變發(fā)生率高于青年組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組患者FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、C-KIT突變率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

2.5 2組基因突變數(shù)目分析結(jié)果比較老年組患者發(fā)生2種及以上基因突變的比例高于青年組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組患者發(fā)生1種基因突變的比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 2組基因突變數(shù)目分析結(jié)果比較 n(%)

3 討論

AML是血液系統(tǒng)高發(fā)的惡性腫瘤之一，AML的發(fā)病中位年齡大于60歲，且隨著年齡的增長，治療效果逐漸下降。隨著中國老齡化社會的到來，AML的發(fā)病率逐漸增加，同時(shí)老年AML亦會逐年增加[4]。老年AML國際標(biāo)準(zhǔn)定義為≥60歲，因此本文根據(jù)患者年齡分為老年組(≥60歲)和青年組(<60歲)。

AML的診斷方式，自20世紀(jì)以來已經(jīng)從依靠形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)這種單一的診斷模式，發(fā)展為形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等多種診斷技術(shù)的精準(zhǔn)診斷。診斷技術(shù)的發(fā)展使得人們對AML的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性更加了解，從而衍生出不同的靶向治療。靶向藥物的治療可提高AML的治療效果，但因?yàn)轶w質(zhì)差、并發(fā)癥多、化療耐受性差、具有獨(dú)特的不良反應(yīng)等眾多因素的影響[5]，使得老年AML患者從靶向藥物的治療中獲益低于年輕患者。綜合來說，即為腫瘤的生物學(xué)特性、治療的耐受性和老年的病理生理特征影響了其治療效果。已有學(xué)者[6]報(bào)道不同年齡AML患者具有不同的分子生物學(xué)特性，且AML患者的分子生物學(xué)特征不同的研究小組報(bào)道存在地域差異。因此本文根據(jù)河南豫北地區(qū)的經(jīng)濟(jì)情況、機(jī)體生理狀態(tài)等，分析豫北地區(qū)≥60歲和<60歲的AML患者的一般特征及常見的生物學(xué)特性，希望總結(jié)本地區(qū)的AML不同年齡組患者的疾病特征，為今后AML患者的治療提供參考。本研究結(jié)果顯示：老年組AML患者紅細(xì)胞減少、血紅蛋白下降和血小板減少的發(fā)生率均高于青年組，而2組患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例相近。從FAB分型方面分析，老年AML以M2型高發(fā)，青年AML以M3型高發(fā)。

目前已有多種分子生物學(xué)標(biāo)記用于疾病的診斷、分型及預(yù)后的評估。2016版WHO的AML診斷分型強(qiáng)調(diào)了遺傳學(xué)信息異常在急性白血病診斷中的價(jià)值，部分伴重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常AML成為了獨(dú)立的分類。這種細(xì)胞遺傳學(xué)的改變與形態(tài)學(xué)特征的關(guān)系尚不明確，少數(shù)異?；蛟谔囟ǖ腁ML中檢出率較高，可以用于診斷某些特殊類型的AML。PML-RARAα融合基因由t(15；17)(q22;q21)染色體易位形成，主要見于AML-M3，陽性率超過80%。AML1-ETO融合基因t(8；21)(q22;q22)染色體易位形成，其陽性多見于AML-M2，劉恒[7]報(bào)道其陽性率為17.4%，高于國外學(xué)者的研究，但其在M2b型的陽性率高達(dá)90%，因此其是M2b分型診斷重要的分子標(biāo)志。還有一部分融合基因在多種疾病中可以檢測到，在AML中檢出率較低，但多與AML的預(yù)后密切相關(guān)，提示預(yù)后欠佳，如BCR-ABL1融合基因由t(9；22)(q34;q11)染色體易位形成，多見于急性淋巴細(xì)胞白血病，少數(shù)可見于AML[8]；NUP98-HoxA9融合基因是由t(7;11)(p15; p15)染色體易位形成，Hox基因可促進(jìn)髓系的增殖，目前認(rèn)為與AML形成密切相關(guān)[9]；MLL-AF9融合基因是t( 9; 11) ( p22; q23)易位形成，是MLL融合基因最常見的一種易位形成，多見于AML-M4、AML-M5[10]。本文研究了AML常見的43種融合基因，總體檢出率為36.7%，比國內(nèi)王鈺等[11]報(bào)道的檢出率35.9% 略高；檢出的融合基因分別為AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11、BCR-ABL1、MLL-AF9、NUP98-HoxA9，2個(gè)年齡段患者6種融合基因的檢出率相近。

新一代測序技術(shù)為AML個(gè)體化診斷和治療開辟了新的視野[12]。在過去的5～10 a中，新一代測序技術(shù)已被廣泛引入專業(yè)的血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室。在AML患者中已檢測到越來越多的基因突變，這些突變可作為潛在的標(biāo)志物，可發(fā)展為AML的預(yù)后參數(shù)、靶向治療的選擇依據(jù)，并幫助我們探索新的潛在治療途徑或耐藥機(jī)制。Yu等[13]報(bào)道了老年和年輕AML患者新一代測序技術(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老年患者的診斷時(shí)分子基因突變的頻率顯著高于年輕患者；老年患者RUNX1、TP53、IDH2、SF3B1和ASXL1基因突變的頻率明顯更高；對比分析老年患者和年輕患者AML基因突變類別發(fā)現(xiàn)，老年AML患者的DNA甲基化相關(guān)基因突變發(fā)生率更高，可達(dá)87.7%；但在年輕的AML患者中，轉(zhuǎn)錄失調(diào)與激活的信號相關(guān)基因突變之間似乎沒有差異。國內(nèi)外同樣有相關(guān)報(bào)道證實(shí)老年AML患者以DNMT3A基因突變高發(fā)，而中青年患者以FLT3-ITD基因突變多發(fā)[14]。DNMT3A屬于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族，承擔(dān)了DNA的甲基化修飾工作，是造血干細(xì)胞分化的必需物，其通過影響造血干細(xì)胞的某些調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮作用。在AML中DNMT3A基因突變發(fā)生率為14%～34%[14]，且DNMT3A基因突變易伴發(fā)其他突變，如在AML中DNMT3A基因突變?nèi)菀渍T發(fā)FLT3-ITD基因突變發(fā)生，發(fā)生這種雙突變的AML患者誘導(dǎo)緩解率較低，復(fù)發(fā)率和死亡率高[15]。DNMT3A基因突變在AML患者中的意義未明，部分學(xué)者認(rèn)為DNMT3A基因突變提示AML預(yù)后差。王麗娟[16]報(bào)道了AML患者中DNMT3A基因突變發(fā)生率為9.76%，且認(rèn)為DNMT3A基因突變?yōu)閺?fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；DNMT3A基因突變可能會改變某些白血病亞型的獨(dú)特基因表達(dá)譜。本文根據(jù)豫北地區(qū)患者的經(jīng)濟(jì)能力，行5種常見AML基因突變測序分析，196例患者檢出率為37.2%，稍高于國內(nèi)學(xué)者的報(bào)道；老年患者DNMT3A基因突變發(fā)生率高于青年患者，與國內(nèi)學(xué)者報(bào)道相似；且老年患者更易發(fā)生2種及以上的基因突變，這也是老年AML患者預(yù)后差的主要原因之一。

總之，河南豫北地區(qū)老年和青年初診AML患者臨床病理特征存在一定差異；與青年組比較，老年組患者外周血紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板水平較低，DNMT3A突變率較高，且易出現(xiàn)多基因突變。本文通過對豫北地區(qū)AML患者的特征分析，為今后本地區(qū)AML患者的治療提供一定的參考。