史文嫻，劉曉菲，李斐斐，王曉娜，孫 穎

1.山東中醫(yī)藥大學(濟南 250335)；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(山東省中醫(yī)經典名方協同創(chuàng)新中心)(濟南250335)；3.山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院(濟南 250335)

乳腺癌是發(fā)生于乳房的惡性腫瘤，目前臨床上已經成為女性最常見的惡性腫瘤之一，對女性的生活質量和生命健康帶來嚴重的威脅。目前大多數學者認為乳腺癌癌前病變是其癌變過程之必經環(huán)節(jié)，是可以逆轉和阻斷的，所以發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，對患者的個體化治療,逆轉或阻斷這一環(huán)節(jié),對乳腺癌二級預防、降低乳腺癌發(fā)病率具有重要意義[1-2]。乳腺惡性腫瘤中最能有效提高生存率、降低死亡率的重要方法是二級預防，臨床上早期乳腺癌的發(fā)現率僅25%[3]，中醫(yī)逐漸成為乳腺癌治療的方法，整體觀念和辨證論治思想指導用藥，具有很大的發(fā)展?jié)摿4]。目前研究發(fā)現，以Bcl-2蛋白家族的表達和調控對腫瘤細胞凋亡具有較大的影響[5]，細胞色素C蛋白的表達在細胞凋亡和炎癥中發(fā)揮著積極作用[6]。基于此，本實驗采用中藥陽和化巖湯與三苯氧胺相比，研究其對乳腺癌癌前病變細胞凋亡關鍵因子Bcl-2、細胞色素C蛋白及基因表達的影響。

材料與方法

1 材 料

1.1 細胞系來源：乳腺癌癌前病變細胞為MCF-10AT細胞，由陳紅風主任(上海龍華醫(yī)院)惠贈。

1.2 藥物與試劑：DMEM/F-12培養(yǎng)基，RNA提取試劑盒(Trizol)、胰蛋白酶粉(Trypsin)、DMSO、MTT、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、RNA酶、驢抗兔IgG，化學發(fā)光劑、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、ECL發(fā)光劑、蛋白酶抑制劑、蛋白上樣緩沖液、胎牛血清(FBS)、碘化丙啶(Propidium iodide，PI)、Western及IP細胞裂解液，細胞色素C、Bcl-2一抗，BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京凱基生物科技公司)，逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)，RT-PCR試劑盒(Invitrogen公司)，RT-PCR所有引物(Invitrogen公司)，及其余常規(guī)生化試劑。

1.3 儀器：BB16uv/BB5060uv CO2培養(yǎng)箱、Axiovert 40倒置相差顯微鏡、Elx50型洗板機、ELx808全自動酶標儀、Sgavplus型超純水系統(tǒng)、水平電泳槽、ClassⅡ2085型超凈工作臺、LAS-4000型化學發(fā)光及熒光影像分析儀、DT5-3型低速自動平衡離心機、ME235P電子分析天平、梅特勒-托利多DELTA320型pH計、Veriti 96孔型梯度PCR儀、FACSCalibur 流式細胞儀，HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)、冷凍超速離心機、CA-1390-1超凈工作臺(上凈公司)、CM1900型冰凍切片機(LEICA公司)、一次性平皿、凝膠成像儀、石蠟包埋機、天能凝膠成像分析系統(tǒng)、顯影機、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀等。

2 實驗方法

2.1 中藥制備：陽和化巖湯組由鹿角霜、山慈菇、莪術、白花蛇舌草各12 g，淫羊藿、三棱、浙貝、半夏各9 g組成。制劑：將10倍量的水加入上述中藥方，6 h內提取收集其揮發(fā)油，保存、備用；提取揮發(fā)油后的藥液濾過，濃縮至1∶1.5(藥材：中藥藥液)，加入適量乙醇，使乙醇含量達到60%，靜置24 h后，將上清液分離，離心中藥液沉淀，減壓、回收，乙醇濃縮，將相對密度濃縮至1.18(60℃)，備用。將揮發(fā)油加入上述藥物提取液中混勻，倒入提取液中，攪拌均勻，另倒入梨酸、山蔗糖調節(jié)pH值，并加水將其濃度調整到0.84 g/ml。采用上述方法制備各拆方組，溫陽組(鹿角霜、淫羊藿各12 g)0.21 g/ml、活血組(三棱9 g、莪術12 g)0.21 g/ml、化痰組(半夏、浙貝各9 g)0.18 g/ml、解毒組(白花蛇舌草、山慈菇各12 g)0.27 g/ml。三苯氧胺(TAM)制備：溶于生理鹽水，濃度為0.03 mg/ml。對照組不加任何處理因素。

2.2 腸吸收液制備：禁食12 h的大鼠斷頸椎處死，迅速剖開腹腔取出小腸，自回盲瓣向上5 cm處向上取14 cm小腸段，將腸內容物完全取出，在TYRODE液中沖洗腸管，并翻轉腸管，結扎成囊狀，將前處理中藥液預先加入麥氏浴管中，通入95%的O2和5%的CO2,37 ℃恒溫，同時開始計時，分別在15、30、45、60、90、120 min取樣200 μl，同時補充等體積TYRODE,-20℃保存待用。用氮氣吹干前處理所得陽和化巖湯腸吸收液，將1 ml的80%的甲醇加入中藥液復浴，超聲3 min，渦旋30 s。0.2 μg濾膜過濾。把腸吸收液混勻后，用無菌濾膜濾過除菌，所得樣品分裝于無菌EP管，-20℃保存待用。

2.3 Western blot法檢測Bcl-2、細胞色素C蛋白表達：檢測陽和化巖湯組、溫陽組、活血組、化痰組、解毒組、三苯氧胺組及空白對照組處理乳腺癌癌前病變MCF-10AT細胞株72 h，收集細胞，用冷PBS反復洗滌2次，加入 200 μl 預冷裂解緩沖液，混勻、冰浴，時間為30 min，30 min后進行離心，取上清液，加水稀釋，至濃度為50 μg /ml，取等量70 μg /泳道的蛋白，電泳條件：濃縮膠恒壓60 V，時間20 min，分離膠恒壓80 V ，時間80 min。電轉移至PVDF 膜，取脫脂奶粉(濃度為5%)將其封閉，時間1 h，劑量0.1 ml/cm2，另加入適量一抗及封閉液， Bcl-2：細胞色素C的稀釋比例為1∶400。搖蕩孵育，溫度4℃下過夜。用PBST漂洗過的PVDF膜和與HRP 結合稀釋比例1∶5000的二抗，搖蕩孵育，溫度：室溫，時間： 1～2 h， PBST 充分洗膜。顯影液(0.1 ml/cm2)計算用量， PVDF 膜上加顯影液，顯影并洗像。調整時間使其曝光，直至出現最佳條帶。

2.4 RT- PCR法檢測Bcl-2、細胞色素CmRNA表達：將細胞分別用液氮研磨粉碎后放入離心管中,Trizol法提取總RNA,每只總RNA 量為2 μ,內參照為擴增GAPDH,每個標本至少重復3遍。引物序列:COX-2長度為253 bp,上游:5’-AGCAGCCATTCATCAACACT-3’,下游:5’-GGCAGCTGGAACTCAATGTA-3,內參長度為286 bp,上游:5’-GCCAGATCATCATCAGCAAT-3’,下游:5’-AGGACGTCCACTGACACCTT-3’，VEGFC長度為164bbp,上游:5’-CGGGCTGTGGATCCTGGATGACCGCC-3’，下游:5’-GGAATTCAGCTCCATTGACTTCTTGG-3’;VEGFR-3長度為189 bp,上游:5’-ACCGGAGCTAAACAAGGATG-3’,下游:5’-TGGTGGTGGAACTTCTTTCC-3’;恒溫70 ℃，加熱時間為5 min，2 min迅速冷卻，42 ℃溫浴60 min，然后升高溫度至95 ℃，加熱時間為5 min，以終止反應逆轉錄合成cDNA，94 ℃條件下加熱3 min進行預變性，然后開始循環(huán)操作：溫度94 ℃，時間45 s，溫度52 ℃，時間60 s，溫度72 ℃，時間60 s，共循環(huán)操作30次,最后溫度72 ℃延伸，時長7 min。取10 μl擴增產物在2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，電泳分離終止后，用Band Scan 4.3版圖像分析軟件分析，取電泳條帶的光密度值與內參照GAPDH光密度值的比值，作為目標基因的相對光表達量。

結 果

1 Bcl-2、細胞色素C蛋白表達比率 與空白組比較，各組Bcl-2蛋白表達比率均下降，陽和化巖湯組、活血組、化痰組、三苯氧胺組比率下降(P<0.05)；與三苯氧胺組比較，陽和化巖湯組(P>0.05)。見表1。

表1 Western blot法檢測Bcl-2蛋白表達比率

與空白組相比，各組細胞色素C蛋白表達比率均下降，陽和化巖湯組、三苯氧胺組(P<0.05)；陽和化巖湯組、三苯氧胺組組間比較(P>0.05)。見表2。

表2 Western blot法檢測細胞色素C蛋白表達比率

空白對照組Bcl-2 mRNA表達量最高，與空白對照組相比，各組Bcl-2 mRNA表達量呈明顯下降趨勢。空白對照組細胞色素C mRNA表達量最低，與空白對照組相比，各組細胞色素C mRNA表達量呈明顯上升趨勢(圖1)。

注：1陽和化巖湯組；2溫陽組；3活血組；4化痰組；5解毒組；6三苯氧胺組；7空白對照組

2 Bcl-2 mRNA表達 見表3(圖2)?？瞻讓φ战MBcl-2 mRNA表達量最高，三苯氧胺組、陽和化巖湯組、解毒組Bcl-2 mRNA表達量呈明顯下降趨勢，尤其陽和化巖湯組Bcl-2 mRNA表達量下降明顯，與三苯氧胺組比較，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)?？瞻讓φ战MBcl-2 mRNA表達量最高，三苯氧胺組、陽和化巖湯組、解毒組Bcl-2mRNA表達量呈明顯下降趨勢。

表3 RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA表達量

注：1陽和化巖湯組；2溫陽組；3活血組；4化痰組；5解毒組；6三苯氧胺組；7空白對照組

圖2 RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA表達

3 RT-PCR檢測細胞色素C mRNA表達 陽和化巖湯組、三苯氧胺組細胞色素C mRNA表達比率高于空白對照組，與三苯氧胺組比較陽和化巖湯組無統(tǒng)計學差異，均可抑制細胞增殖。其余4個中藥拆方組細胞色素C mRNA表達比率有增高趨勢，但無統(tǒng)計學差異。提示三苯氧胺組、陽和化巖湯組均促進細胞色素C蛋白表達增高， mRNA表達比率增高，基因有擴增，提示三苯氧胺組、陽和化巖湯組在細胞凋亡早期可有效促進凋亡誘導因子細胞色素C，通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。見表4?？瞻讓φ战M細胞色素C mRNA表達量最低，三苯氧胺組、陽和化巖湯組細胞色素CmRNA表達量均有升高趨勢(圖3)。

表4 RT-PCR檢測細胞色素C mRNA表達量

注：與空白對照組相比，△P<0.05

注：1陽和化巖湯組；2溫陽組；3活血組；4化痰組；5解毒組；6三苯氧胺組；7空白對照組

圖3 RT-PCR檢測細胞色素C mRNA表達量

討 論

本病中醫(yī)學中稱為“乳巖”，乳巖主要病機為六淫內侵，肝脾氣郁，沖任不和，臟腑功能失調，以致氣滯、血瘀、痰凝、邪毒結于乳腺，則表現為乳腺癌。本實驗采用陽和化巖湯進行研究，陽和化巖湯出自《外科醫(yī)鏡》，方中所含多種中藥具有抗腫瘤作用，鹿角霜溫補腎陽腎精、收斂止血，實驗研究示，鹿角霜能通過刺激血液中T淋巴細胞的增殖抑制小鼠乳腺癌細胞生長[7]，鹿角霜還有活血化瘀之效，有利于改善乳腺癌血液高凝狀態(tài)，肉桂補火助陽散寒、益脾除積，肉桂中含有的肉桂醛能參與細胞內信號通路，調節(jié)腫瘤細胞的增殖及凋亡[8]，淫羊藿、鹿角霜溫補少陰，兩者均富含雄激素，既可以補充雄激素又能拮抗雌激素，淫羊藿主要通過降低腫瘤細胞端粒酶活性、抑制腫瘤細胞增殖分化、改變腫瘤細胞周期分布等[9]，浙貝母化痰散結，排癰消腫，浙貝片聯合化療提高腫瘤抑制率的機制可能是調節(jié)細胞凋亡途徑，增加耐藥性強的腫瘤細胞對化療藥的敏感性，從而起到逆轉腫瘤細胞耐藥性的作用[10]，莪術破瘀止痛、行氣解郁，莪術油具有明顯的抗腫瘤作用，許政旭等[11]研究發(fā)現，莪術油可通過下調死亡因子及其受體通路，導致相關癌基因的表達下調，增強免疫作用，使癌細胞凋亡，莪術、三棱均有破血行氣,消積止痛的作用，李學臣等[12]研究發(fā)現三棱水的提取物能夠抑制小鼠腫瘤細胞生長，山慈菇清熱解毒，化痰散結，山慈菇提取物對小鼠乳腺癌細胞增殖具有明顯的抑制作用和促凋亡作用[13]，白花蛇舌草清熱解毒，其中的萜類化合物可通過調節(jié)凋亡相關基因、抗氧化作用等抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[14]，甘草有調和諸藥之效[15]。全方共奏活血祛瘀與溫腎助陽之功，攻補兼施，溫陽化痰法對延長乳腺癌患者的生存期有至關重要的療效，溫陽化痰法能起到減毒增效的作用，既能減緩乳腺癌細胞增殖，又能調節(jié)信號通路，抑制乳腺癌的癌變進程[16]，陽和化巖湯可抑制乳腺癌癌細胞的增殖，誘導乳腺癌癌細胞的凋亡[17]。

他莫昔芬是絕經前激素受體陽性乳腺癌輔助內分泌治療的標準藥物，是合成的抗雌激素藥物，具有抗雌激素、弱雌激素的雙重作用，競爭性的結合靶細胞ER，降低細胞內ER含量，抑制腫瘤細胞的生長代謝，有效降低乳腺癌復發(fā)風險和病死率[18]，對雌激素受體陽性的患者效果好。此外，它還可以通過阻斷因雌激素引起的乳腺管及管周纖維組織增生，幫助增生的乳腺組織恢復正常的水平[19]。

抑制細胞生長的主要途徑是細胞凋亡，導致哺乳動物細胞凋亡的反應分兩大類，包括內源性途徑(線粒體途徑)和外源性途徑。Bcl-2是細胞凋亡研究中發(fā)揮關鍵作用的癌基因之一。Bcl-2主要分布在線粒體外膜表面，可以保護線粒體的完整性，進而阻止相關活化因子(如CytC)的釋放，從而阻斷凋亡信號，減輕細胞損傷。當Bcl-2表達較多時，與Bax形成大量異源二聚體，抑制Bax活性，使細胞凋亡減緩受阻，抑制大多數化療藥物所引起的靶細胞凋亡。細胞凋亡是一種由基因調控的細胞主動死亡過程，在機體生長發(fā)育、細胞分化和病理狀態(tài)中起著重要的作用，在線粒體介導的內源性凋亡通路中，細胞色素C從線粒體釋放到胞漿細胞是凋亡程序關鍵的一步，研究表明，線粒體轉運孔孔徑可以在凋亡刺激信號作用下增大，破壞線粒體的外膜，細胞色素C蛋白從線粒體內釋放到胞質當中，形成凋亡復合體，使DNA修復酶活性受到抑制，細胞核的內切酶被激活，進而切割DNA，導致細胞凋亡。

綜上所述，陽和化巖湯可明顯降低Bcl-2蛋白及mRNA表達，激活細胞色素C，加速癌細胞的凋亡及阻斷相關通路活化，進而抑制癌變進程。