陳金玉，曲金萍，張坤生，閆怡君，任云霞

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

苦蕎麥又被稱(chēng)為三角麥，是一種糧藥兼?zhèn)涞馁Y源[1]。苦蕎麥最早起源于中國(guó)，在中國(guó)各地均有種植，其面積和產(chǎn)量居世界第二位。蕎麥尤其是苦蕎麥，在所有糧食作物中，不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還含有其他糧食作物所缺少的藥用成分和特種微量元素?？嗍w麥含有多種生物活性成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，對(duì)絕大多數(shù)中老年心腦血管和現(xiàn)代“文明病”均有預(yù)防和治療作用[2]。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，苦蕎蛋白具有一系列顯著的生理功效，如降低膽固醇、改善便秘、調(diào)節(jié)血糖和血脂、抑制脂肪蓄積和預(yù)防腫瘤等[3]，而這些保健功效很可能與苦蕎蛋白的消化特性有關(guān)[4]?？嗍w蛋白的氨基酸組成比較均衡，約含有17種氨基酸，其中8種為人體必需氨基酸。在這8種必需氨基酸中，除亮氨酸外，剩余大多數(shù)氨基酸含量都高于小麥粉和玉米，尤其以一般植物缺乏的賴(lài)氨酸和精氨酸最為豐富，這兩種氨基酸恰恰是組成人體血液即血漿蛋白的主要成分[5-6]?？嗍w蛋白的制備方法主要有堿溶酸沉法[7]、乙醇提取法、酶解法等。研究表明，蛋白水解得到的多肽具有一系列顯著的生理生物活性，如抗氧化[8]、降血壓、抗凝血、抗腫瘤、抗菌、提高免疫力等[9]，因此研究苦蕎蛋白水解產(chǎn)物對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)苦蕎新功能產(chǎn)品具有潛在的市場(chǎng)價(jià)值和應(yīng)用前景[10]。

本文以DPPH自由基清除能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選酶法制備苦蕎蛋白抗氧化肽的最適酶。在此基礎(chǔ)上，以水解度為指標(biāo)，利用單因素和響應(yīng)面模型分析法優(yōu)化酶解工藝條件，而后進(jìn)一步利用超濾法、凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)苦蕎蛋白水解物進(jìn)行分離純化，考察不同級(jí)份的抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果為深入探究苦蕎蛋白水解物的抗氧化活性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石油醚（30℃～60℃沸程）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）：上海麥克林生化試劑有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、牛血清蛋白：Sigma試劑公司；葡聚糖凝膠（G-15）：北京索萊寶試劑有限公司。

SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鞏義市毛華儀器有限公司；BECKMAN COULTER離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；FD-A-50冷凍干燥機(jī)：上海皓莊儀器有限公司；IKA T10高速組織勻漿機(jī)：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；A2004A電子天平：上海精天儀器有限公司；HITACHI U-5100型分光光度計(jì)：日立高新技術(shù)公司；EL20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；超濾離心管：美國(guó)Millipore有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苦蕎蛋白的提取

參考李宗杰[11]的方法，將苦蕎麥粉按料液比1∶2（g/mL）加入30℃～60℃沸程的石油醚中，置于通風(fēng)櫥中不斷攪拌，待大部分石油醚揮發(fā)后，用布氏漏斗過(guò)濾，并在通風(fēng)櫥中晾干，得到脫脂蕎麥粉。將干燥的脫脂蕎麥粉與蒸餾水按1∶10（g/mL）混合，調(diào)節(jié)pH值為8.0，在 50℃下水浴 30min。離心（9000r/min）20min，收集上清液并調(diào)節(jié)pH值為4.5（苦蕎蛋白等電點(diǎn)約為4.5），再次離心得到沉淀。沉淀物用去離子水多次沖洗后調(diào)節(jié)其pH值為7.0，真空冷凍干燥，即為苦蕎蛋白。

1.2.2 水解產(chǎn)物的制備

稱(chēng)取適量苦蕎蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液（pH 7）中，樣品濃度為2%，勻漿30 s，調(diào)節(jié)pH值，加入一定量酶進(jìn)行水解。結(jié)束后，將酶解液置于沸水中滅酶10 min，冷卻至室溫（25℃），調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為4.5，離心（5 500 r/min）15 min，取上清液，真空冷凍干燥得到酶解產(chǎn)物粉末。

1.2.3 蛋白酶的篩選

分別采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)提取的苦蕎蛋白進(jìn)行水解，以抗氧化活性為指標(biāo)篩選最佳用酶。各酶水解的條件見(jiàn)表1。

表1 各酶較適宜的水解條件[12]Table 1 The suitable hydrolysis conditions of each enzyme[12]

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 時(shí)間對(duì)苦蕎蛋白水解度的影響

以1.2.3中篩選的酶為最適酶進(jìn)行水解，酶與底物添加質(zhì)量比為1∶50，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值至2.0，置于37℃恒溫水浴鍋中水解 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 后，迅速放入沸水浴中滅酶10 min，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響。

1.2.4.2 溫度對(duì)苦蕎蛋白水解度的影響

選擇1.2.4.1中篩選的最佳反應(yīng)時(shí)間，調(diào)節(jié)pH值至2.0，酶與底物添加質(zhì)量比為1∶50，分別置于23、30、37、44、51℃水浴鍋中水解2.0 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶，考察溫度對(duì)水解度的影響。

1.2.4.3 pH值對(duì)苦蕎蛋白水解度的影響

選擇1.2.4.1和1.2.4.2中篩選的最佳反應(yīng)時(shí)間和溫度，酶與底物添加質(zhì)量比為1∶50，調(diào)節(jié)pH值分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，置于 37 ℃恒溫水浴鍋中酶解2.0 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶，考察pH值對(duì)水解度的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以水解度值為響應(yīng)指標(biāo)，以pH值、溫度和時(shí)間為響應(yīng)因子，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定苦蕎蛋白多肽制備的最佳工藝條件。試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 水解度的測(cè)定

將水解液與等體積20%三氯乙酸溶液混合，離心（1 600 r/min）30 min，取上清液 1 mL于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，劇烈振蕩后，放置30 min，于波長(zhǎng)540 nm測(cè)定吸光度值。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)[13]?？嗍w蛋白的水解度計(jì)算公式如下：

水解度/%=上清液蛋白濃度/總蛋白濃度×100

1.2.7 超濾分離

苦蕎蛋白水解物通過(guò)UF超濾膜（截留分子量為3 kDa）進(jìn)行超濾，超濾條件為：25℃、離心轉(zhuǎn)速4 500 r/min、30 min，收集濾過(guò)液（＜3 kDa）和未濾過(guò)液（＜3 kDa），并分別測(cè)定兩種級(jí)分的DPPH自由基清除率，選取抗氧化活性強(qiáng)的級(jí)分冷凍干燥，于-20℃保存，繼續(xù)進(jìn)行下一步凝膠色譜分離純化。

1.2.8 凝膠過(guò)濾色譜分離

將樣品配成一定濃度，取5 mL上樣于經(jīng)超純水平衡后的葡聚糖凝膠（G-15）過(guò)濾柱，用超純水進(jìn)行洗脫，流速為0.8 mL/min，自動(dòng)收集器每6 min收集1管，分別檢測(cè)每管洗脫液的吸光度值（214 nm），并繪制洗脫曲線(xiàn)。收集各峰對(duì)應(yīng)組分，測(cè)定其DPPH自由基清除率。

1.2.9 抗氧化能力測(cè)定

1.2.9.1 還原能力

取1mL待測(cè)溶液與0.2mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH 6.6）及1.5 mL 0.3%鐵氰化鉀溶液混合，50℃反應(yīng)20 min。依次加入1 mL三氟乙酸（10%）、0.5 mL三氯化鐵（0.3%）和3 mL蒸餾水，搖勻，測(cè)定700 nm處吸光值。

1.2.9.2 DPPH自由基清除率

參考Zheng等[14]的方法并稍作修改。取2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液與2 mL樣品待測(cè)液，混合避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)吸光度值?？瞻捉M用乙醇代替DPPH溶液；對(duì)照組為無(wú)水乙醇代替樣品與DPPH乙醇溶液混合。計(jì)算公式如下：

式中：A1為試驗(yàn)組吸光度；A2為空白組吸光度；A3為對(duì)照組吸光度。

1.2.9.3 ABTS＋自由基清除率

取0.2mL待測(cè)溶液于試管中，加入3.8mL的ABTS＋工作液（配置方法參考文獻(xiàn)[14]），室溫（25℃）避光反應(yīng)6 min后，于734 nm處測(cè)定吸光值。計(jì)算公式如下：

式中：A1為樣品與ABTS＋反應(yīng)后的吸光值；A2為樣品自身的吸光值；A3為未加樣品的ABTS＋吸光值。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并用Duncan多重比較檢驗(yàn)各處理平均數(shù)之間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性見(jiàn)圖1。

圖1 不同酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of the corresponding products of each enzyme hydrolysis

由圖1可知，在3種酶的水解作用下，胃蛋白酶的水解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，當(dāng)胃蛋白酶濃度為1.5 mg/mL時(shí)，其自由基清除率最高達(dá)到71.25%，且隨著胃蛋白酶濃度的增加，水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率呈逐漸升高的趨勢(shì)。堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的清除能力最低。胃蛋白酶水解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力優(yōu)于胰蛋白酶和堿性蛋白酶，可能是因?yàn)槊糠N酶的切割位點(diǎn)有較大差異，產(chǎn)生的多肽序列不同[15]，從而導(dǎo)致水解產(chǎn)物的最終抗氧化能力不同。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 時(shí)間對(duì)苦蕎蛋白水解度的影響

時(shí)間對(duì)苦蕎蛋白水解度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)苦蕎蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of time on degree of hydrolysis of tartary buckwheat protein

由圖2可知，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，苦蕎蛋白的水解度呈現(xiàn)先升高后逐漸平緩的趨勢(shì)，在水解時(shí)間為2 h時(shí)其水解度較高，為26.21%。這可能是因?yàn)榈鞍酌副３只盍Φ臅r(shí)間是一定的，超過(guò)一定時(shí)間后，酶的活性會(huì)逐漸下降。此外，水解時(shí)間在2 h之前，蛋白沒(méi)有充分被水解；而2 h之后，苦蕎蛋白在酶的作用下基本被完全水解，且隨著底物消耗殆盡，反應(yīng)進(jìn)程增加緩慢，從而使水解度呈現(xiàn)平緩的趨勢(shì)。

2.2.2 溫度對(duì)苦蕎蛋白水解度的影響

溫度對(duì)苦蕎蛋白水解度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)苦蕎蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis of tartary buckwheat protein

由圖3可見(jiàn)，溫度對(duì)苦蕎蛋白水解反應(yīng)的影響比較顯著，溫度過(guò)高或者過(guò)低對(duì)水解度均有負(fù)面影響。隨著溫度的升高，苦蕎蛋白水解度呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為37℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值（27.67%）。這可能是因?yàn)?7℃為胃蛋白酶的最適溫度，此時(shí)可以最大程度的發(fā)揮胃蛋白酶的催化酶切效果；而過(guò)高或過(guò)低的溫度都會(huì)對(duì)酶的活力產(chǎn)生不利影響，不能使酶與底物充分結(jié)合，從而導(dǎo)致水解度較低[16]。

2.2.3 pH值對(duì)蕎麥蛋白水解度的影響

pH值對(duì)蕎麥蛋白水解度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)蕎麥蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of pH on degree of hydrolysis of tartary buckwheat protein

由圖4可見(jiàn)，酶解pH在1.0～1.5之間時(shí)，苦蕎蛋白水解度隨著pH值的增加而增大，pH值為1.5時(shí)，蛋白水解度最大，為27.19%，說(shuō)明該酸性條件最利于酶與底物相結(jié)合。當(dāng)pH值大于1.5時(shí)，水解度明顯降低，可能是因?yàn)樵損H值條件影響酶活性中心上必需基團(tuán)的解離程度和催化基團(tuán)中質(zhì)子供體或質(zhì)子受體所需的離子化狀態(tài)[17]，因此影響了酶與底物的結(jié)合，從而使苦蕎蛋白水解度降低。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取溫度、pH值、時(shí)間3個(gè)因素，以水解度作為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 Design and results of response surface experiment

利用Design Expert 7.0軟件對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行回歸分析，所得的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the response surface regression model

回歸模型的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)R2為0.979 5，校正相關(guān)系數(shù) R2Adj為 0.953 1，該模型的 P＜0.000 1，表明該響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平；失擬項(xiàng)P（0.078 1）＞0.05，不顯著。以上數(shù)據(jù)表明，得到的模型和試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度較好。根據(jù)回歸系數(shù)，得出苦蕎蛋白水解度的二次多元回歸方程為：Y=30.31＋3.21X1＋1.74X2＋1.88X3＋2.36X1X2＋2.08X1X3＋1.52X2X3-2.35X12-6.88X22-3.60X32。

回歸系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明，酶解溫度、pH值、時(shí)間對(duì)水解度的影響極顯著，時(shí)間與溫度交互項(xiàng)（X1X2）、時(shí)間二次項(xiàng)（X12）、溫度二次項(xiàng)（X22）、pH 值二次項(xiàng)（X32）對(duì)應(yīng)響應(yīng)值為極顯著；時(shí)間與pH值交互項(xiàng)（X1X3）、溫度與 pH 值交互項(xiàng)（X2X3）對(duì)應(yīng)響應(yīng)值為顯著。該回歸方程較好地描述了各變量因素與響應(yīng)值水解度之間的真實(shí)關(guān)系，可通過(guò)該方程確定苦蕎蛋白酶解的最佳工藝條件。

在響應(yīng)曲面上可根據(jù)圖的坡度反映各因素對(duì)水解度的影響[18]。根據(jù)回歸方程做出三維曲面及等高線(xiàn)圖，如圖5～圖7所示。

圖5 酶解時(shí)間與溫度的交互作用Fig.5 Interaction between enzymatic hydrolysis time and temperature

圖6 酶解時(shí)間與pH值的交互作用Fig.6 Interaction between enzymatic hydrolysis time and pH

圖7 酶解溫度與pH值的交互作用Fig.7 Interaction between enzymatic hydrolysis temperature and pH

圖5顯示當(dāng)時(shí)間不變時(shí)，隨溫度的增加，水解度先增加后降低，變化幅度顯著（P＜0.01），且時(shí)間和溫度的等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明時(shí)間和溫度對(duì)水解度的交互作用顯著[19]。圖6顯示隨時(shí)間和pH值增加，水解度先增加后降低；pH值和溫度的等高線(xiàn)接近圓形，說(shuō)明pH值和溫度的交互作用不顯著。圖7顯示水解度隨溫度與pH值的增加先升高后降低，溫度與pH值的等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明溫度與pH值的交互作用顯著，且等高線(xiàn)沿著pH值軸方向比溫度方向密集，說(shuō)明pH值對(duì)水解度的影響比溫度顯著。

2.4 最佳工藝的驗(yàn)證

利用Design Expert 7.0軟件得到苦蕎蛋白最佳酶解工藝：時(shí)間2.45 h，溫度38.61℃，pH 1.73。為方便實(shí)際操作，將最佳工藝條件設(shè)為：時(shí)間2.5 h、溫度38℃、pH 2.0。此條件下苦蕎蛋白的水解度達(dá)到（32.68±0.21）%，與理論預(yù)測(cè)值32.77%基本吻合，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化苦蕎蛋白酶解工藝是可行的。

2.5 超濾

超濾分離組分及其抗氧化活性見(jiàn)表5。

本試驗(yàn)采用超濾離心管對(duì)制備的苦蕎蛋白水解物進(jìn)行膜超濾分離，得到了2種分子量組成的抗氧化肽：I（＜3 kDa）和II（＞3 kDa）。其中級(jí)份I占58.3%，級(jí)份II占41.7%，由此可見(jiàn)，苦蕎蛋白水解物多肽主要以小分子量肽段（＜3 kDa）組成。試驗(yàn)進(jìn)一步采用DPPH法考察級(jí)份I和級(jí)份II的抗氧化能力，由表5可知，級(jí)份I（＜3 kDa）具有更低的IC50值，即低分子量組分的抗氧化活性較強(qiáng)，高分子量組分的抗氧化活性較弱?？赡苁且?yàn)樾》肿恿慷嚯挠捎谄潆逆溳^短，導(dǎo)致空間位阻較小，因此內(nèi)部的活性基團(tuán)更容易暴露，便于其與自由基反應(yīng)[20]。這與李華等[21]和王章存等[22]的研究結(jié)果類(lèi)似。

2.6 凝膠過(guò)濾色譜

進(jìn)一步將抗氧化活性較強(qiáng)的級(jí)份I進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜分離，分離曲線(xiàn)見(jiàn)圖8。

圖8 凝膠過(guò)濾分離曲線(xiàn)Fig.8 Gel filtration separation curve

如圖8所示，級(jí)份I經(jīng)凝膠色譜分離后得到3個(gè)峰。峰1最先被洗脫出來(lái)，保留時(shí)間較短，說(shuō)明峰1的分子量較大，不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而最先流出凝膠柱[23]。峰2和峰3的保留時(shí)間較長(zhǎng)，說(shuō)明峰2和峰3組分分子量較小，在流經(jīng)凝膠柱時(shí)進(jìn)入顆粒內(nèi)部從而延長(zhǎng)洗脫時(shí)間。

2.7 凝膠分離各峰的抗氧化活性比較

凝膠分離各組分的抗氧化活性見(jiàn)表6。

表6 凝膠分離各組分的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of each component separated by gel chromatography

由表6可知，3種抗氧化評(píng)價(jià)體系均顯示峰3組分的抗氧化活性最強(qiáng)，其次是峰2，峰1的抗氧化能力最弱。結(jié)合圖8可以發(fā)現(xiàn)，峰3組分的強(qiáng)抗氧化活性可能與其分子量有關(guān)，小分子量酶解肽具有較好的抗氧化效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，分別用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)提取的苦蕎蛋白進(jìn)行酶解，得到胃蛋白酶為制備苦蕎蛋白抗氧化肽的最適酶。通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化苦蕎蛋白水解工藝，得到最佳工藝條件：時(shí)間2.5 h、溫度38℃、pH 2.0，在此條件下苦蕎蛋白水解度為32.68%。采用超濾法和凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)苦蕎蛋白水解物分離純化，結(jié)果表明，分子量＜3 kDa的水解物具有顯著的抗氧化活性，經(jīng)凝膠色譜進(jìn)一步分離得到3個(gè)峰組分，小分子量峰組分顯示出最強(qiáng)的抗氧化活性。本研究為后續(xù)試驗(yàn)深入研究苦蕎蛋白抗氧化活性肽奠定良好基礎(chǔ)。