張春玲 陳露 趙偉

[摘要]目的：探討丹銀海綿對糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合的影響。方法：將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為8組。除空白對照組外，其余7組大鼠，通過手術(shù)在其背部形成一10mm×10mm相同大小，深達(dá)肌層的潰瘍，分別給予抗生素、生長因子凝膠、納米銀、丹黃散，以及不同濃度的丹銀海綿處理潰瘍面。給藥28d后處死大鼠，取潰瘍部位新生肉芽組織，HE染色觀察組織形態(tài)的變化;Western Blot檢測大鼠創(chuàng)面組織中AGEs、hs-CRP、IL-1、IL-6、bFGF、PDGF、VEGF表達(dá)水平。結(jié)果：病理切片觀察顯示適宜濃度的丹銀海綿可以促進(jìn)血管新生并伴擴(kuò)張，同時生成大量新生成纖維細(xì)胞。Western Blot檢測顯示高濃度的丹銀海綿可以顯著上調(diào)創(chuàng)面組織中生長因子表達(dá)（P<0.05），降低AGEs水平及炎癥因子表達(dá)（P<0.05）。結(jié)論：適宜濃度的丹銀海綿對于糖尿病大鼠皮膚潰瘍的愈合有明顯的促進(jìn)作用，提高治療效果。

[關(guān)鍵詞]丹銀海綿;糖尿病;皮膚潰瘍;AGEs;生長因子;炎癥因子;創(chuàng)面愈合

[中圖分類號]R285 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2020）03-0071-04

Abstract： Objective ?To investigate the effect of Dan silver sponge on wound healing of diabetic rats with skin ulcers. Methods ?Male Wistar rats were randomly divided into 8 groups. Except for the control group， in the other 7 groups of rats， a 10mm×10mm ulcer was created on the back by surgery， and the depth of the ulcer reached the muscle layer. Treatment of ulcers with antibiotics， growth factor gel， nanosilver， Danhuang powder， and different concentrations of Dan silver sponge.The rats were sacrificed 28d after administration， and the new granulation tissue of the ulcer was taken. The histomorphological changes were observed by HE staining. The expression levels of AGEs， hs-CRP， IL-1， IL-6， bFGF， PDGF and VEGF in rat wound tissues were detected by Western Blot. Results ?Pathological sections showed that the appropriate concentration of Dan silver sponge can promote angiogenesis and expansion， and generate a large number of new fibroblasts. Western Blot assay indicated that high concentration of Dan silver sponge significantly up-regulated the expression of growth factor in wound tissue （P<0.05）， and decreased the expression of AGEs and inflammatory factors （P<0.05）. Conclusion ?The appropriate concentration of Dan silver sponge can promote the healing of skin ulcer in diabetic rats and improve the efficacy.

Key words： Dan silver sponge; diabetes; skin ulcers; AGEs; growth factors; inflammatory factors; wound healing

糖尿病是一種全身慢性代謝性疾病[1]。糖尿病皮膚潰瘍（Diabetic cutaneous ulcers，DCU）是指因糖尿病患者長期血糖控制不佳引起神經(jīng)以及不同程度的末梢血管病變，從而導(dǎo)致感染、潰瘍形成和或深部組織的破壞，是糖尿病患者致死致殘的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2-4]。DCU的治療效果至今尚不理想，且隨著近年來糖尿病患者的日益增多，DCU所造成的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日趨沉重，故亟需研制新的治療方法提高其臨床療效[4-5]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)丹黃散可有效促進(jìn)DCU的愈合，但其抗菌性較差，有一定的局限性[6-7]。大量研究顯示納米銀具有廣譜抗菌、不產(chǎn)生耐藥、且生物兼容性良好的特點[8-10]。因此，本研究將丹黃散與具有良好抗菌作用的納米銀有機(jī)結(jié)合，通過動物實驗觀察其對糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的影響，現(xiàn)報道如下。

1 ?材料和方法

1.1 試劑與藥品：丹黃散制劑（選購丹參、大黃、當(dāng)歸、沉香、松香、沒藥六味中藥按1：1：1的比例制成丹黃散制劑，由醫(yī)院藥劑科制備完成）;納米銀海綿（羥甲基殼聚糖與硝酸銀的混合溶液制成納米銀海綿，低、中、高濃度丹銀海綿分別含硝酸銀11.11%、16.67%、22.22%，由醫(yī)院中心實驗室制備完成）;丹銀海綿（納米銀海綿負(fù)載丹黃散，由醫(yī)院中心實驗室制備完成）;鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（Sigma）;檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（Sigma）;艾科靈睿血糖儀及試紙（艾康生物技術(shù)有限公司）;重組人表皮生長因子凝膠（批號：14020213）。

1.2 實驗動物：健康雄性Wistar大鼠40只，體重180～220g，購自重慶國家生物產(chǎn)業(yè)基地實驗動物中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組：隨機(jī)分為空白對照組、抗生素組、生長因子組、納米銀組、丹黃散組、低濃度丹銀海綿組、中濃度丹銀海綿組、高濃度丹銀海綿組共8組，每組5只。

1.3.2 糖尿病大鼠模型的制備：空白對照組采用普通飼料喂養(yǎng)，其余7組采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)20d，禁食12h后腹腔注射10% STZ 40mg/kg，第7天測空腹血糖高于16.7mmol/L時，認(rèn)為糖尿病模型制備成功。造模過程中失敗的大鼠隨時補(bǔ)充。

1.3.3 皮膚潰瘍樣本制備及干預(yù)：1周后，對大鼠腹腔注射水合氯酸進(jìn)行麻醉，選擇背部面積10mm×10mm區(qū)域，剃去毛發(fā)，龍膽紫染色標(biāo)記，無菌條件下剪去標(biāo)記部位皮膚，深達(dá)肌層，形成潰瘍區(qū)。皮膚創(chuàng)面形成后，將制備所得的糖尿病潰瘍感染模型大鼠隨機(jī)分為7組，納米銀組采用銀納米涂抹潰瘍部位;丹黃散組采用“丹黃散”外敷換藥;低濃度丹銀海綿組采用低濃度丹銀海綿外敷換藥;中濃度丹銀海綿組采用中濃度丹銀海綿外敷換藥;高濃度丹銀海綿組采用高濃度丹銀海綿外敷換藥;生長因子組采用重組人表皮生長因子凝膠換藥;抗生素組采用亞胺培南西司他丁鈉換藥;另取正常大鼠5只按上述方法造模后做為第8組空白對照組，不加任何干預(yù)方法。

1.3.4 主要觀察指標(biāo)

1.3.4.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：實驗后28d處死大鼠，取潰瘍部位新生肉芽組織，置于-80℃保存?zhèn)溆?，部分肉芽組織以福爾馬林保存。創(chuàng)面新生肉芽組織采用HE染色觀察創(chuàng)面新生組織中毛細(xì)血管增生情況與細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;

1.3.4.2 創(chuàng)面組織因子測定：用Western Blot方法檢測新生肉芽組織，測定大鼠創(chuàng)面組織中AGEs、hs-CRP、IL-1、IL-6、bFGF、PDGF、VEGF表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，兩樣本比較應(yīng)用t檢驗，多樣本比較應(yīng)用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 創(chuàng)面組織病理觀察：HE染色鏡下顯示：丹黃散組可見大量新生的成纖維細(xì)胞和擴(kuò)張的毛細(xì)血管，組織結(jié)構(gòu)緊密，較粗血管周圍可見袢狀彎曲的毛細(xì)血管網(wǎng)，與空白對照組相比炎癥細(xì)胞浸潤較少。低濃度納米銀海綿組中上述現(xiàn)象更為顯著，大量新生血管形成伴有擴(kuò)張、有大量新生成纖維細(xì)胞促使組織結(jié)構(gòu)緊密。詳見圖1。

2.2 各組創(chuàng)面組織AGEs表達(dá)水平：空白對照組、抗生素組、生長因子組、納米銀組、丹黃散組、不同濃度（低、中、高）丹銀海綿組創(chuàng)面組織中AGEs水平進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其中高濃度丹銀海綿組創(chuàng)面組織AGEs水平均明顯低于其余7組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;但高濃度丹銀海綿組與中濃度丹銀海綿組創(chuàng)面組織AGEs水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。詳見表1。

2.3 各組創(chuàng)面組織炎癥因子表達(dá)：空白對照組、抗生素組、生長因子組、納米銀組、丹黃散組、不同濃度（低、中、高）丹銀海綿組創(chuàng)面組織中炎癥介質(zhì)hs-CRP、IL-1、IL-6含量進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其中高濃度丹銀海綿組、中濃度丹銀海綿組創(chuàng)面組織炎癥因子水平均明顯低于其余6組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳見表2。

2.4 各組創(chuàng)面組織生長因子表達(dá)：對照組、抗生素組、生長因子組、納米銀組、丹黃散組、不同濃度（低、中、高）丹銀海綿組創(chuàng)面組織中生長因子bFGF、EGF、VEGF表達(dá)進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其中高濃度丹銀海綿組、中濃度丹銀海綿組創(chuàng)面組織bFGF、PDGF、VEGF表達(dá)均明顯高于其余6組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;但高濃度組與中濃度組創(chuàng)面組織bFGF、PDGF、VEGF表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計意義（P>0.05）。詳見表3。

3 ?討論

祖國醫(yī)學(xué)將糖尿病歸于“脫疽”“瘡瘍”的范疇，病機(jī)屬本虛標(biāo)實之癥，治療以益氣活血、通絡(luò)化瘀、清熱解毒、祛腐生肌為主[11]。前期研究已證實具有清熱解毒、活血利濕、祛腐生肌的中藥丹黃散可以促進(jìn)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合，縮短愈合時間，但抗感染效果不佳。納米銀具有抗菌性，抗耐藥性，臨床廣泛應(yīng)用于潰瘍、燒傷等的治療中[9-10]。因此，本課題組將納米銀與丹黃散相結(jié)合，制備出不同濃度的丹銀海綿，觀察其對糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的影響，以期提高DCU的治療效果，減輕患者、家庭、社會的負(fù)擔(dān)。

創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜的過程，包括創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、上皮內(nèi)皮及血管新生、基質(zhì)形成和膠原合成，涉及可溶性介質(zhì)如生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子，細(xì)胞外基質(zhì)與不同細(xì)胞因子之間的協(xié)調(diào)作用[10，12]。AGEs的產(chǎn)生可間接刺激創(chuàng)面炎性因子合成，加重集體炎癥反應(yīng)[13];同時AGEs的聚集，能降低生長因子糖基化能力[14]，進(jìn)一步影響創(chuàng)面愈合進(jìn)程。說明AGEs的產(chǎn)生及積聚是糖尿病皮膚創(chuàng)面修復(fù)失控的本質(zhì)[15]。本研究結(jié)果顯示與其他組比較，外敷高濃度丹銀海綿組的糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面組織中，AGEs水平降低，提示適宜濃度的丹銀海綿可通過干預(yù)AGEs的表達(dá)影響創(chuàng)面愈合。

hs-CRP、IL-1、IL-6等炎癥因子在DCU創(chuàng)面中的分泌，可刺激血管內(nèi)皮因子釋放，同時導(dǎo)致神經(jīng)組織血流減少，從而加重創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，抑制潰瘍創(chuàng)面愈合[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，其余七組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥因子含量均有所減少，且中濃度與高濃度丹銀海綿組的上述炎癥因子的含量下降程度明顯高于其他各組，說明適宜濃度的丹銀海綿外敷可以減輕DCU創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)組織愈合。

炎癥反應(yīng)是影響糖尿病皮膚創(chuàng)面潰瘍愈合的重要因素，而bFGF、PDGF、VEGF等生長因子的表達(dá)，則直接影響了新生血管的形成，從而直接決定了組織愈合的速度[18-19]。本研究結(jié)果顯示與空白對照組相比，其余七組大鼠創(chuàng)面組織中生長因子表達(dá)均有所上調(diào)，且中濃度與高濃度丹銀海綿組的生長因子表達(dá)上調(diào)程度明顯高于其他各組，說明丹銀海綿外敷可以促進(jìn)生長因子表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)血管新生，進(jìn)一步促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合。