任慶 熊銳華 黎輝 黃林 蔣小月 趙曉莉

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 廣西 桂林 541199)

本研究對(duì)AKT-GSK-3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控吉西他濱對(duì)肝癌細(xì)胞化療敏感性進(jìn)行了研究。

1.資料與方法

1.1 研究對(duì)象

采用SMMC-7721傳代肝癌細(xì)胞、HepG2傳代肝癌細(xì)胞。

1.2 主要試劑與儀器

高糖DMEM、胎牛血清、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、0.25%胰蛋白酶、蛋白上樣緩沖液、脫脂奶粉、0.45nm PVDF膜、ECL發(fā)光顯影液，Bio-rad Image Lab凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)、生物安全柜。

1.3 方法

1.3.1肝癌細(xì)胞培養(yǎng) 將完全培養(yǎng)液制作出來(lái)，其包含青鏈霉素+10%胎牛血清+高糖DMEM，在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中對(duì)HepG2細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞取出來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[1]。

1.3.2吉西他濱作用后肝癌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞取出來(lái)，分別將細(xì)胞懸液制作出來(lái)，在六孔板中加入2.5×105個(gè)/孔數(shù)量。在細(xì)胞融合率在50%-70%之間時(shí)，用20μg/ml吉西他濱分別進(jìn)行18h作用。Western blot對(duì)肝癌細(xì)胞中BAX、Bcl-2蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 吉西他濱作用下肝癌細(xì)胞AKT/GSK-3β通路激活檢測(cè)

用吉西他濱在肝癌細(xì)胞作用，Western blot對(duì)總AKT、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4阻斷通路后肝癌細(xì)胞凋亡情況 吉西他濱作用前1h用PI3K/AKT特異抑制劑LY294002將該通路阻斷，然后用吉西他濱在肝癌細(xì)胞作用，再次進(jìn)行Westren blot對(duì)肝癌細(xì)胞中BAX、Bcl-2蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，以對(duì)化療效果受到AKT/GSK-3β信號(hào)通路的影響進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 吉西他濱化療后肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，見(jiàn)表1。

表1 吉西他濱化療后肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況分析（±s）

表1 吉西他濱化療后肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況分析（±s）

肝癌細(xì)胞 時(shí)間Anti-Bcl-2Anti-BAXAnti-GAPDH SMMC-7721化療前1.00±0.311.01±0.321.00±0.30化療后0.49±0.123.00±1.000.94±0.31 HepG2化療前1.00±0.331.00±0.121.00±0.24化療后0.31±0.102.74±0.910.96±0.31

2.2 吉西他濱誘導(dǎo)AKT/GSK-3β信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況，見(jiàn)表2。

表2 吉西他濱誘導(dǎo)AKT/GSK-3β信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況（±s）

表2 吉西他濱誘導(dǎo)AKT/GSK-3β信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況（±s）

肝癌細(xì)胞 時(shí)間Anti-p-AKTAnti-AKTAnti-p-GSK-3βser9Anti-GAPDH SMMC-7721化療前1.00±0.311.01±0.321.02±0.301.00±0.30化療后3.01±1.001.01±0.302.69±0.811.02±0.32 HepG2化療前1.00±0.311.01±0.321.00±0.301.01±0.32化療后3.71±1.201.41±0.411.12±0.303.01±1.00

2.3 阻斷AKT/GSK-3β通路后化療肝癌細(xì)胞凋亡情況，見(jiàn)表3。

表3 阻斷AKT/GSK-3β通路后化療肝癌細(xì)胞凋亡情況（±s）

表3 阻斷AKT/GSK-3β通路后化療肝癌細(xì)胞凋亡情況（±s）

肝癌細(xì)胞 時(shí)間Anti-Bcl-2Anti-BAXAnti-GAPDH SMMC-7721化療前1.00±0.311.01±0.321.00±0.30化療后0.76±0.231.50±0.420.96±0.31阻斷后0.50±0.132.25±0.710.92±0.30 HepG2化療前1.00±0.331.00±0.121.00±0.24化療后0.50±0.121.25±0.401.13±0.31阻斷后0.25±0.082.54±0.821.10±0.30

3.討論

本研究結(jié)果表明，吉西他濱化療后SMMC-7721、HepG2的Anti-Bcl-2、Anti-GAPDH顯著低于化療前；而Anti-BAX表達(dá)均顯著高于化療前（P＜0.05）見(jiàn)表1。吉西他濱化療后SMMC-7721、HepG2的Anti-p-AKT、Anti-p-GSK-3βser9表達(dá)均顯著高于化療前（P＜0.05）。化療前、化療后、阻斷后SMMC-7721、HepG2的Anti-Bcl-2表達(dá)均逐漸降低（P＜0.05），Anti-BAX表達(dá)均逐漸升高（P＜0.05），見(jiàn)表2，和相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致[2]。

綜上所述，AKT-GSK-3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控吉西他濱對(duì)肝癌細(xì)胞化療敏感性高，值得進(jìn)一步深入研究。