張玉潔 孫怡琳 朱蘋 郟雁飛 張倩 馬曉麗，△

(1.濰坊醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，山東 濰坊 261053；2.西北農林科技大學理學院，陜西 楊凌 712100 3.山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院中心實驗室，山東 濟南 250013)

肺癌是最常見的癌癥死亡原因，肺癌的五年存活率僅為15%[1-2]，缺乏有效的非小細胞肺癌(NSCLC)診斷手段是NSCLC患者高病死率的主要原因之一。胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBPs)是與Ⅰ型胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor type Ⅰ，IGF-Ⅰ)有高特異性結合的蛋白大家族，其中IGFBP-3在血清中含量最為豐富[3]。IGFBP-3作為分泌蛋白，在組織或循環(huán)中與除IGF之外的許多配體相互作用，且IGFBP-3在細胞內的相互作用可以在不依賴IGF-IGF 1R信號傳導途徑的情況下發(fā)生[4]，提示IGFBP-3是肺癌發(fā)生相關的生物標志物之一[5-7]。增殖細胞核抗原(Ki-67)是一種重要的核增殖蛋白，在臨床上常用于標記細胞增殖狀態(tài)的抗原，它的表達水平與肺癌的惡性程度密切相關[8]。P53是非常重要的抑癌基因，約1/3的肺癌發(fā)現(xiàn)有P53基因的突變，對肺癌的形成起重要作用[9-11]。本研究通過檢測NSCLC患者血清IGFBP-3 及組織中TP53、Ki-67的表達，結合患者吸煙等臨床病理參數(shù)，分析其臨床意義，為肺癌的診斷和治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1一般資料 選擇2017年8月至2019年2月在濟南市中心醫(yī)院胸外科及腫瘤科收治的45歲以上NSCLC患者57例。病理診斷標準根據世界衛(wèi)生組織2015年頒布的《肺腫瘤組織學分類》確定；對所有病例根據首次確診時的病歷資料進行肺癌TNM分期，腫瘤TNM分期標準根據國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2017年1月頒布實施的肺癌TNM分期標準。排除標準：事先經過放、化療，靶向治療的患者樣本；合并其他部位的惡性腫瘤；影響IGF家族蛋白表達的疾病；合并自身免疫性疾病等。病例均具有明確的病理分期及組織學類型，病歷資料完整。健康體檢者納入標準：>18歲健康查體者，均無心、肝、肺、腎等重要器官疾病，且無高血壓、高血脂、糖尿病等基礎性疾病。記錄所有受試者的年齡、性別、吸煙史、臨床病史、病理分期等資料。收取肺癌患者手術后的肺癌組織樣本，分別取癌及癌旁部位組織，將其固定在多聚甲醛溶液內，制石蠟切片。本研究得到山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院倫理委員會批準，并得到入組患者和健康體檢者的知情同意。

1.2ELISA檢測血清IGFBP-3濃度 清晨抽取空腹的57例NSCLC患者，以及在體檢中心選取體檢報告為健康的22名健康對照者的肘靜脈血5 mL于添加有惰性分離膠和促凝劑的黃色采血管中，取血后2 h內離心，3 000 rpm/min離心10 min后，分離血清到1.5 mL的Eppendorf 3810型微量離心管，凍存于-80 ℃冰箱。采用Thermo Multiskan GO全波長酶標儀及人IGFBP-3 ELISA檢測試劑盒(來自武漢華美生物公司CUSABIO，批號為CSB-E04590h)檢測血清IGFBP-3水平。操作過程嚴格按試劑盒說明書進行。使用前將試劑從冰箱移至室溫平衡30 min；將血清標本按照1：50的比例稀釋后加入樣本孔，封閉后于37 ℃孵育2 h；洗板3次后加檢測抗體，37 ℃孵育1 h；洗板5次后依次加顯色液、終止液；光密度在各樣本孔加入終止液后5 min內用酶標儀在450 nm波長處依次測量。標準曲線采用4-PL法繪制。

1.3HE染色及免疫組化檢測組織P53、Ki-67 石蠟切片進行常規(guī)HE染色[12]。采用EnVision二步法染色，將收取NSCLC觀察病例的石蠟組織切片經脫蠟、熱抗原修復及血清封閉后，分別孵育Ki-67單克隆抗體(北京中杉金橋，ZM-0165)和P53兔抗人單克隆抗體(Abcam，ab131442)過夜，二抗孵育后，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，中性樹膠封片。Ki-67結果判讀：選擇腫瘤細胞染色均勻的區(qū)域，Ki-67核染色(點狀或彌散)認定為陽性反應，計數(shù)至少500個腫瘤細胞中Ki-67陽性染色的腫瘤細胞，以其所占的比例為Ki-67表達陽性率。P53結果判讀：選擇P53胞質和胞核染色的腫瘤細胞認定為P53陽性細胞，P53陽性細胞占整個切片總腫瘤細胞的百分比計為P53表達的陽性率。結果由兩名病理科醫(yī)生采用雙盲法判讀，本研究以≥1%定義為陽性表達。

2 結 果

2.1NSCLC患者與健康人血清IGFBP-3水平及診斷價值分析 以22例健康人為對照組。NSCLC患者血清IGFBP-3水平顯著降低，其中肺腺癌[(1 114.29±321.27) ng/mL VS(1 628.08±478.70) ng/mL，P<0.001]、肺鱗癌[(1 101.73±224.74) ng/mL VS (1 628.08±478.70) ng/mL，P=0.003]患者血清IGFBP-3水平均低于健康人，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過繪制受試者工作特征曲線(ROC)，ROC曲線下面積為0.817(P<0.001)。當IGFBP-3濃度取界值1 139.10 ng/mL時，診斷價值最大，靈敏度為81.3%，特異度為57.7%(圖1)。

注：A.與健康對照者相比，非小細胞肺癌患者血清中IGFBP-3顯著降低，*P<0.05，**P<0.001；B.血清IGFBP-3表達量診斷非小細胞肺癌的ROC曲線。

圖1NSCLC患者血清IGFBP-3表達水平及診斷價值分析

2.2肺腺癌的HE染色及P53和Ki-67蛋白在NSCLC患者癌和癌旁組織中的表達 肺腺癌患者癌組織及癌旁組織的HE染色結果見圖2。57例NSCLC組織經免疫組化后分析，P53蛋白呈細胞核表達24例，陽性率42.11%，陽性率高于癌旁組織(P<0.01，圖3A～B)。Ki-67蛋白呈細胞核表達29例，陽性率50.88%，陽性率高于癌旁組織(P<0.01，圖3C～D)。

注：A.肺腺癌組織(10×)；B.肺腺癌癌旁組織(10×)。

圖2肺腺癌患者癌及癌旁組織的HE染色

2.3IGFBP-3、P53及Ki-67在NSCLC中的表達與臨床病理參數(shù)的關系 根據IGFBP-3臨界值1139.10ng/mL，低于此濃度為陰性，高于此濃度為陽性。免疫組化方法檢測57例NSCLC患者手術切除的組織標本中P53、Ki-67的表達，和肺腺癌癌旁組織相比，根據肺癌組織中P53、Ki-67的陽性率，分別分析IGFBP-3、P53、Ki-67的表達與各個臨床參數(shù)之間的相關性，結果見表1。血清IGFBP-3的表達與吸煙史有關，組織P53、Ki-67的陽性表達與吸煙史、淋巴結轉移和分化程度有關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫物大小、病理類型等參數(shù)無關。

表1 臨床病理特征 [(%)]

2.4IGFBP-3、P53、Ki-67表達的相關性 57例患者血清IGFBP-3濃度與P53蛋白的表達呈顯著負相關(P=0.004)，P53陽性組的IGFBP-3濃度值為(989.866±315.974) ng/mL，顯著低于P53陰性組的IGFBP-3濃度值(1 328.871±324.561) ng/mL(P=0.004)。Ki-67陰性組IGFBP-3濃度(987.122±252.280) ng/mL高于Ki-67陽性組的濃度值(987.122±252.280) ng/mL，但二者無統(tǒng)計學差異(P=0.117)。57例NSCLC患者組織中P53和Ki-67蛋白表達存在相關性(r=-0.590，P<0.001)，見表2。

表2 P53與Ki-67表達的相關性

3 討 論

IGFBP-3通過IGF-Ⅰ抑制相關的信號通路途徑影響NSCLC發(fā)生[13]，IGFBP-3過表達或腫瘤內注射過表達IGFBP-3的病毒可抑制腫瘤發(fā)生[14]，也有研究[15]表明，下調的IGFBP-3有抑制癌癥進展的作用，目前關于IGFBP-3在腫瘤中的研究存在爭議，其機制有待進一步研究。在腫瘤患者體內，IGFBP-3可與ALS(一種類似三元復合物的物質)穩(wěn)定結合，并且其濃度也與ALS的濃度密切相關[16]。人血清中的IGFBP-3主要通過復合物的形成翻譯后調節(jié)[17]。盡管IGF-I / IGFBP-3在臨床研究中具有診斷價值，但IGF-I/IGFBP-3比率具有明顯的局限性，因為IGF家族最豐富的配體IGF-II可與IGF-I競爭結合，與IGFBP-3結合起作用[18]。此外，目前仍沒有一致的證據表明血清IGFBP-3水平與肺癌等癌癥發(fā)展或癌癥預后風險之間存在關聯(lián)[19-20]。

本研究結果顯示，IGFBPP-3在NSCLC患者中的表達顯著下降，且與患者的吸煙史密切相關，與腫瘤分化、淋巴結轉移有相關趨勢；P53、Ki-67蛋白表達與NSCLC患者的吸煙史、淋巴結轉移和分化程度密切有關，且IGFBP-3與P53呈顯著負相關，P53和Ki-67表達存在相關性，提示IGFBP-3表達在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起作用。

本研究前期通過TCGA數(shù)據庫分析發(fā)現(xiàn)，IGFBP-3在肺癌及癌旁組織中的基因表達無顯著差異。Oncomine 數(shù)據庫分析顯示，IGFBP-3在肺癌組織中的基因表達顯著高于癌旁組織。研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-3蛋白在肺癌中的表達較癌旁組織的表達降低，且參與肺癌的發(fā)生發(fā)展?？梢奍GFBP-3在肺癌發(fā)生中的表達及作用存在爭議，有待進一步研究。

本實驗結果顯示，NSCLC患者血清中IGFBP-3水平顯著低于健康對照者，且吸煙患者中血清IGFBP-3的水平顯著降低，表明IGFBP-3是肺癌發(fā)生的負相關因子，這與之前的研究結果一致[21]。同時，IGFBP-3與肺癌的TNM分期、淋巴結轉移有相關趨勢，但無統(tǒng)計學意義。組織中P53、Ki-67表達與肺癌淋巴結轉移、遠處轉移和分化程度正相關，IGFBP-3與P53呈顯著負相關，P53和Ki-67表達存在相關性，提示IGFBP-3是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的標志物之一，有待大數(shù)據樣本進一步驗證[22]。本實驗通過評估IGFBP-3作為腫瘤標志物的診斷價值及其與P53、Ki-67表達的相關性，提示血清檢測IGFBP-3有助于腫瘤狀態(tài)評估，進一步研究IGFBP-3的作用機制，可以為肺癌診療提供分子理論基礎。

注：A.P53在癌組織中的表達；B.P53在癌旁組織中的表達；C.Ki-67在癌組織中的表達；D.Ki-67在癌旁組織中的表達。

圖3P53和Ki-67在NSCLC患者癌及癌旁組織中的表達(20×)