陶志清 雷玲 魯伊 鄭樂(lè)婷文靜 李晞 趙鋮△

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，(1.風(fēng)濕免疫科；(2.檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530021)

系統(tǒng)性硬化病(SSc)是一種多系統(tǒng)疾病，以皮膚、肺、腎臟、胃腸道和心臟大量沉積膠原蛋白和其他結(jié)締組織成分為特征。免疫系統(tǒng)失調(diào)和自身抗體的產(chǎn)生導(dǎo)致血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致組織的纖維化，組織纖維化反映了膠原蛋白產(chǎn)生和降解之間的不平衡，細(xì)胞損傷和異常愈合導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白特別是膠原蛋白在不同器官的積累[1]。ECM的過(guò)度沉積導(dǎo)致組織纖維化，損害組織結(jié)構(gòu)和器官功能，組織中ECM蛋白的數(shù)量是通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)對(duì)其產(chǎn)生和降解的平衡來(lái)控制的[2]。MMPs按其結(jié)構(gòu)域可分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)蛋白酶、母系蛋白酶和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶。MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)是MMPs家族的著名酶，對(duì)膠原有廣泛的底物特異性。MMP-2和MMP-9對(duì)原纖化膠原在最初被膠原酶裂解后的降解有相當(dāng)大的影響，這兩種明膠酶具有膠原蛋白水解活性，并能夠裂解其他幾種ECM蛋白[3]。因此，明膠酶在纖維化疾病的ECM穩(wěn)態(tài)和發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。本研究通過(guò)檢測(cè)博萊霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠模型皮膚、肺組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)量，分析MMP-2、MMP-9改變?cè)赟Sc發(fā)生中的可能機(jī)理，為其治療及預(yù)后提供新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠16只，體重25 g左右，6～8周齡，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，自由飲水、攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有實(shí)驗(yàn)方案及操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 Thal(常州制藥廠)，BLM(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，HYP測(cè)試盒( 南京建成生物研究所) ，引物(上海生工生物公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 純化試劑盒、熒光定量PCR試劑(日本TaKaRa 公司)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物建模及分組 將16只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分對(duì)照組與SSc組，每組8只，硫化鈉溶液脫去小鼠背部中央的毛，約2.0 cm×2.0 cm。對(duì)照組于小鼠背部脫毛處中央?yún)^(qū)皮下注射PBS 0.1 mL，SSc組注射用1 mg/mL的博來(lái)霉素0.1 mL， 1次/d，連續(xù)注射3周后處死，取背部皮膚和肺進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2HE染色和Masson染色 取小鼠的皮膚、肺組織進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋，切片，行HE染色和Masson染色，測(cè)量鏡下小鼠皮膚的厚度，皮膚和肺部炎癥的程度：0表示無(wú)；1表示少許；2表示輕度；3表示中度；4表示重[4]。隨機(jī)選擇切片區(qū)域，由兩位病理科醫(yī)生進(jìn)行盲法閱片，按照Ashcroft 半定量進(jìn)行纖維化程度評(píng)分[5]。

1.3.3羥脯氨酸含量的測(cè)定 采用樣本堿水解法，檢測(cè)皮膚和肺的HYP含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.4熒光定量PCR法(rt-qPCR)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá) 取小鼠左肺上葉肺組織和背部皮膚各約80 mg，應(yīng)用柱式法提取總RNA，應(yīng)用oligo dT引物與random引物搭配進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。應(yīng)用SYBR GreenI染料法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以β-actin 為內(nèi)參照，各樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各引物序列：β-actin：上游5’-ATCCACGAAACTACCTTCAA-3’，下游：5’-CCAAATTGTATTGCAGATGTTCCAC-3’；MMP-2引物上游序列：5’TGGCACCACCGAGGACTATGAC3’，下 游：5’ACACCACACCTTGCCATCGTTG3’；MMP-9引物序列：上游：5’GGAGCACGGCAACGGAGAAG3’，下游：5’CCTGGTCATAGTTGGCTGTGGTG3’。將所得Ct值按照2-ΔΔCt的方法進(jìn)行處理。

2 結(jié) 果

2.1小鼠模型皮膚、肺病理的作用 HE染色和Masson’s染色顯示，對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，少量膠原沉積；模型組小鼠可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡、肺間質(zhì)及支氣管壁周圍成纖維細(xì)胞增多并伴纖維組織增生，膠原明顯增多；SSc組肺部炎癥以及纖維化評(píng)分較對(duì)照組明顯增加 (P<0.01)。HE染色和Masson染色顯示 ：SSc組小鼠皮膚組織學(xué)上基本正常，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，少量膠原沉積；SSc組皮損處真皮層明顯增厚，表皮萎縮，真皮層明顯增厚，血管壁增厚、管腔狹窄，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維增多；SSc組皮膚厚度、炎癥較對(duì)照組明顯增加 (P<0.01)。見(jiàn)圖1及圖2。

2.2小鼠羥脯氨酸含量 與對(duì)照組相比，模型組皮膚和肺組中HYP含量明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 小鼠皮膚、肺病理及羥脯氨酸含量

2.3小鼠皮膚、肺組織中的MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá) 與對(duì)照組比較，SSc組小鼠肺組織 MMP-9 mRNA 表達(dá)水平增加，(P<0.01)，SSc組小鼠皮膚和肺MMP-2、皮膚MMP-9mRNA 表達(dá)水平增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3及圖4。

3 討 論

SSc是一種多系統(tǒng)纖維化的自身免疫性疾病。細(xì)胞損傷和細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及血管生成因子的異常持續(xù)產(chǎn)生導(dǎo)致組織修復(fù)失調(diào)。結(jié)締組織穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成和降解之間的平衡。器官組織中ECM成分的過(guò)度沉積會(huì)導(dǎo)致纖維化，從而破壞器官的功能[1]，而ECM的降解主要受MMPs的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，HE和Masson染色顯示SSc小鼠皮膚和肺炎癥及纖維化程度增加，膠原增多，皮膚增厚，HYP含量增加，這與我們的前期研究[6-7]結(jié)果一致。結(jié)果顯示，SSc小鼠皮膚和肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)量升高。MMP-2和MMP-9的增加引起基底膜的破壞和成纖維細(xì)胞對(duì)肺泡的侵襲，從而有利于纖維的形成，MMP-2和MMP-9在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)患者中表達(dá)升高[8]，這與本研究結(jié)果一致。提示MMP-2、MMP-9在SSc的纖維化發(fā)生發(fā)展起重要作用。伴有間質(zhì)性肺疾病的SSc(SSc-ILD)患者與無(wú)ILD患者和健康對(duì)照組相比，支氣管肺泡灌洗液中MMP-9的含量和活性均有所增加[9]。有研究[10]采用明膠酶譜法檢測(cè)SSc小鼠肺組織MMP-9活性增加，但是MMP-2并沒(méi)有增加，然而在皮膚組織中MMP-2、MMP-9活性增加。C.Meng等[11]研究表明，彌漫性系統(tǒng)性硬化病(dSSc)患者皮膚中MMP-9的表達(dá)明顯低于正常組，然而MMP-9水平在局限性系統(tǒng)性硬化病(lSSc)患者皮膚的表達(dá)和正常組無(wú)明顯差異。這些結(jié)果的差異，有待進(jìn)一步研究探討。

SSc的主要病理特征是纖維化。在研究[12]中，MMP-9的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致減少的纖維化，在另一項(xiàng)研究[13]中認(rèn)為它是促纖維化的，而研究[14]則認(rèn)為它沒(méi)有作用。就像許多MMPs一樣，MMP-9在纖維化中作用的性質(zhì)尚無(wú)定論。這些結(jié)果的差異部分可能是由于病理評(píng)估的時(shí)間造成的，纖維化過(guò)程始于損傷，炎癥，修復(fù)和最終消退，后者在纖維化疾病中被破壞，有研究[15]認(rèn)為，如果MMPs在疾病誘導(dǎo)的早期表達(dá)，它們具有促纖維化作用，但在疾病誘導(dǎo)的后期，它們具有抗纖維化作用。顯然，評(píng)估MMP-9在纖維化中的免疫調(diào)節(jié)作用需要進(jìn)一步深入研究。

MMP-2、MMP-9的表達(dá)增加，究竟是機(jī)體對(duì)博萊霉素的纖維化效應(yīng)的防御反應(yīng)，還是這種過(guò)表達(dá)與博萊霉素的纖維化效應(yīng)有協(xié)同作用，目前尚不清楚。由于明膠酶功能的復(fù)雜性、調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性和動(dòng)物研究的缺乏，MMP-2、MMP-9在SSc中的作用仍有許多未知之處，因此需要進(jìn)一步的研究。

注：A、B分別為對(duì)照組、SSc組小鼠皮膚HE染色；C、D分別為對(duì)照組、SSc組小鼠肺HE染色。圖1 小鼠皮膚、肺組織 HE 染色結(jié)果(×200)

注：E、F分別為對(duì)照組、SSc組小鼠皮膚Masson染色；G、H分別為對(duì)照組、SSc組小鼠肺Masson’s染色。圖2 小鼠皮膚、肺組織Masson染色結(jié)果(×200)

圖3 兩組小鼠肺MMP-2、MMP-9mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖4 兩組小鼠皮膚MMP-2、MMP-9mRNA相對(duì)表達(dá)量