侯玲 王玉娜 周永忠

摘 要

[目的]分析MBL基因啟動子區(qū)-221G/C、-550G/C SNP位點在寧夏地區(qū)的分布特征，并探討其與類風濕性關節(jié)炎（RA）發(fā)病的相關性。[方法]采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分型法（PCR-RFLP）和聚合酶鏈式反應-序列特異性引物（PCR-SSP）技術，對400名寧夏健康個體及380名RA患者MBL-221G/C、MBL-550G/C進行基因分型。[結(jié)果]（1）RA患者中：MBL-221G/C、MBL-550G/C的基因型頻率和等位基因頻率分布在不同年齡、不同性別組間的比較中均不存在統(tǒng)計學差異（P>0.05）。（2）在RA患者與健康對照組間的比較中，MBL-550G/C基因型頻率和等位基因頻率分布均存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）。[結(jié)論]（1）RA的發(fā)病在MBL-221和MBL-550多態(tài)位點不受年齡、性別、的影響。（2）MBL-550位的C等位基因可能是寧夏地區(qū)RA發(fā)生的危險因子。

關鍵詞

寧夏;甘露糖結(jié)合凝集素;單核苷酸多態(tài)性;類風濕性關節(jié)炎

中圖分類號： R593.22 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.07.057

Abstract

[Objective] To determine the distribution of Mannose-Binding Lectin（MBL）gene polymorphism in ?Ningxia，To study on the influence of MBL genepolymorphism in RA. [Methods]By using PCR-RFLP and SSP-PCR， we determined MBL genotype and haplotype of MBL-221G/C、MBL-550G/C in 400 healthy people which from Ningxia district， 380 RA patients of Ningxia district. [Results]（1）At MBL-221G/C and MBL-550G/C， There were no statistically significant differences of nation、sex and age in either the frequency of genotypeor that of allele in MBL genepolymorphism of RA patients（P>0.05）. （2）At MBL-550G/C， there were statistically significant differences in MBL genepolymorphism genetictype frequencies between RA patients and healthy（P<0.05）.[Conclusion]（1）The onset of RA is not affected by age ，gender and ethnicity. （2）At MBL-550G/C， C allele probably is one of the risk factors which may lead to RA disease in Ningxia district.

Key words

Ningxia;MBL;SNP;RA

1975年，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞內(nèi)可能存在一種能與甘露糖特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，1978年，Kawasaki T等[1]的研究證實這種蛋白質(zhì)的存在，隨后將此蛋白質(zhì)命名為甘露糖結(jié)合凝集素（MBL），并建立了MBL的cDNA克隆。人MBL基因全長7kb，位于第10號染色體長臂10q11.2-q21。種族、民族、年齡、應激狀態(tài)、基因變異及多態(tài)性等多種因素都會影響MBL血清水平[2]。其中結(jié)構(gòu)基因外顯子Ⅰ密碼子點突變和啟動子區(qū)SNP的調(diào)控對MBL血清濃度影響最大[3]。由于啟動子區(qū)呈現(xiàn)出單核苷酸多態(tài)性（SNP），對MBL基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控，從而使不同種族之間、甚至同一種族不同個體間的MBL血清水平差異顯著[4]。

類風濕性關節(jié)炎（RA）是一種病因不明的、以關節(jié)疼痛、腫脹、畸形為主要臨床特征的慢性全身性疾病，是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的多基因疾病。許多研究表明，MBL基因可能是影響RA疾病發(fā)病的候選基因[5-8]。本課題組在研究MBL基因外顯子Ⅰ密碼子點突變與寧夏地區(qū)RA相關性的基礎上，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分型法（PCR-RFLP）和聚合酶鏈式反應-序列特異性引物（PCR-SSP）技術檢測MBL基因啟動子區(qū)SNP位點多態(tài)性在寧夏地區(qū)的分布特征，并探明其與RA的發(fā)病是否存在相關性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源及處理

基因組DNA樣本來源于寧夏不同地區(qū)。健康對照400例，來源于寧夏不同地區(qū)體檢健康人群，年齡在7歲-73歲之間，其中男性210例、女性190例。RA患者380例，樣本來源于住院患者，RA的診斷以美國風濕病學會（ARA）1987年修訂的RA分類標準為依據(jù)，年齡在7歲-77歲之間，其中男性190例、女性190例。以上研究個體均無血緣關系，追溯3代均為同一民族個體，且在寧夏地區(qū)居住3代以上。根據(jù)知情同意原則，常規(guī)抽取所選個體的外周靜脈血2ml，加入0.2mlACD抗凝劑，充分混勻，進行DNA提取，之后加入100μl的DNA水化液完全溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器

DNA提取試劑盒（北京天根公司），電泳級瓊脂糖（上海生工生物工程技術服務有限公司），PCR引物由上海英駿生物有限公司合成，限制性內(nèi)切酶MspI購自大連寶生生物公司。PCR反應試劑包括：5×PCR反應液、2.5Mm dNTP及LA Taq DNA聚合酶（5U/μl）。丙烯酰胺溶液（Acr：Bis=29：1），分子大小標準物：MarkerⅠ、2000bp DNA Marker。硝酸銀染色試劑。瓊脂糖凝膠電泳試劑包括1×TAE電泳緩沖液、電泳上樣緩沖液、0.5μg/ml的溴化乙錠（EB）。

臺式高速離心機（Eppendrof，Germany），MycycleTM Thermal Cycler型PCR儀（BIORAD公司）。DYY-8B型穩(wěn)壓電泳儀，DYY-32A型水平電泳槽，DYCZ-24A型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）。凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，U.S.A）。

1.2 方法

1.2.1 RFLP-PCR法檢測MBL-221G/C、SSP-PCR法檢測MBL-550G/C

根據(jù)全基因組PCR的引物設計原則，利用Primer Primer5.0軟件，自行設計PCR引物，MBL-221引物序列為：F： 5' –CGGTCCCATTTGTTCTCACTGCCCC-3'，R： 5'- TGTGACACTGCGTGACTA-3'。MBL-550引物序列為：-550c： 5-TGC TTA CCC AGG CAA GCC TGT C-3，-550g： 5-TGC TTA CCC AGG CAA GCC TGT G-3，-550： ?5-CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG-3。

PCR總反應體系為15μl， PCR反應條件：94°C預變性4分鐘后進入循環(huán)，每個循環(huán)為：94℃變性30秒，63℃（MBL-221位點）、60℃（MBL-550位點）退火30秒、72℃延伸1.5分鐘，共循環(huán)30個周期，最后在72°C延伸10分鐘。MBL-221位點PCR產(chǎn)物為152bp，MBL-550位點PCR擴增產(chǎn)物為884bp。

擴增反應結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物3μl與0.5μl電泳上樣緩沖液混勻，依次上樣于2%的瓊脂糖凝膠中，以2000bp DNA Marker做參照，電泳30分鐘后，將瓊脂糖凝膠用0.5μg/ml的溴化乙錠染色15-20分鐘，然后用蒸餾水漂洗2次，紫外燈下判讀PCR擴增情況和MBL-550位基因型。樣本DNA的PCR擴增產(chǎn)物在 Marker兩側(cè)有兩個泳道，若Marker左側(cè)泳道未出現(xiàn)DNA條帶而右側(cè)出現(xiàn)DNA條帶則為野生純合子GG，若Marker左側(cè)泳道出現(xiàn)DNA條帶而右側(cè)未出現(xiàn)DNA條帶則為突變純合子CC，若Marker左側(cè)泳道出現(xiàn)DNA條帶同時右側(cè)也出現(xiàn)DNA條帶則為雜合子GC。

然后將MBL-221位點PCR擴增產(chǎn)物進行MspI內(nèi)切酶酶切，總反應體系為10μl， 37℃水浴酶切1～2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)8%非變性凝膠電泳和硝酸銀染色，用凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果并記錄其基因型，野生純合子GG（127bp，25bp），突變純合子CC（152bp），雜合子GC（152bp，127bp，25bp）。

1.2.2 統(tǒng)計學方法

研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度用？字2檢驗;MBL基因型頻率與等位基因頻率采用頻率計數(shù)法，組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用？字2檢驗。均應用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MBL-221 RFLP-PCR結(jié)果、MBL-550 SSP-PCR結(jié)果

在寧夏地區(qū)健康對照和RA患者中，均檢出MBL-221和MBL-550位點具有單核苷酸多態(tài)變異。

2.2 寧夏地區(qū)MBL基因單核苷酸多態(tài)性分布特征及其與RA相關性

對健康對照的？字2檢驗結(jié)果顯示，本研究人群符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05），具有群體代表性。在分析健康對照和RA患者MBL-221、MBL-550位點多態(tài)性時，進行了性別和年齡分組，年齡段分組依據(jù)聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織提出的年齡分段標準，44歲以下為青年人，45歲以上為中老年人。

2.2.1 寧夏RA患者MBL-221、MBL-550位點多態(tài)性

MBL-221G/C、MBL-550G/C的基因型頻率和等位基因頻率分布在不同年齡、不同性別組間的比較中均不存在統(tǒng)計學差異（P>0.05）（表1，表2）。

2.2.2 寧夏健康對照和RA患者MBL基因頻率和等位基因頻率的比較

在RA患者與健康對照組間的比較中，MBL-221G/C的基因型頻率和等位基因頻率在兩組間的比較中均無統(tǒng)計學差異（P<0.05）（表3）。MBL-550G/C基因型頻率在兩組間存在統(tǒng)計學差異（P<0.05），MBL-550位點C等位基因頻率在RA中的分布高于對照組，其差異性具有統(tǒng)計學意義（P=0.047，OR=1.26，95%CI：1.00～1.59）（表4）。

3 討論

我國類風濕性關節(jié)炎（RA）患病率約為0.3%，患者人數(shù)超過了500萬，本病是造成我國人群喪失勞動力，甚至致殘的主要病因之一，嚴重影響人們的生活質(zhì)量并加重家庭經(jīng)濟負擔。血清MBP作為一種急性反應蛋白會受RA疾病本身的影響，而研究MBL基因單核苷酸多態(tài)性與RA相關性的優(yōu)勢在于MBL多態(tài)性不受RA病程的影響。因此，探討MBL基因作為影響RA疾病發(fā)病候選基因的可能性并對其進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，在篩選RA易感人群，并采取有效的預防和治療措施等方面都具有潛在的應用前景。RA是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的多基因疾病，關于MBL基因單核苷酸多態(tài)性與RA的可能聯(lián)系研究較多，許多研究結(jié)果表明MBL和RA的發(fā)生和發(fā)展可能存在相關性[5-8]。本課題組采用PCR-SSP和PCR-RFLP檢測技術研究了MBL基因啟動子區(qū)MBL-221G/C、MBL-550G/C兩個SNP位點多態(tài)性分布特征及其與寧夏地區(qū)RA發(fā)病的相關性。在RA患者與健康對照組間的比較中，MBL-221G/C的基因型頻率和等位基因頻率在兩組間的比較中均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。因此，在寧夏地區(qū)，MBL-221位單核苷酸多態(tài)性可能與RA的發(fā)病不具有相關性。Ip[9]等對中國南方RA病人與健康對照的MBL表型、基因型及啟動子多態(tài)性進行研究發(fā)現(xiàn)，啟動子區(qū)第550位多態(tài)性在兩組間差異顯著，RA病人血清中MBL水平顯著低于健康對照。本研究結(jié)果顯示，MBL-550G/C基因型頻率和等位基因頻率在兩組間存在統(tǒng)計學差異（P<0.05），RA患者變異純合基因型CC頻率顯著高于健康對照（P=0.009），MBL-550位變異型C等位基因頻率在RA中的分布高于對照組，其差異性具有統(tǒng)計學意義（P=0.047，OR=1.26，95%CI：1.00～1.59）。此研究結(jié)果提示，MBL-550位單核苷酸多態(tài)性可能與寧夏地區(qū)RA的發(fā)病具有相關性，MBL-550位變異型C等位基因可能是寧夏地區(qū)RA發(fā)病的候選基因。比較中國南方和北方寧夏地區(qū)MBL-550位點的多態(tài)性變異和與RA疾病的相關性，結(jié)果是一致的。

對RA患者的研究結(jié)果顯示，MBL-221G/C、MBL-550G/C兩個位點的基因型頻率和等位基因頻率分布在不同民族、不同年齡、不同性別組間的比較中均不存在統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

綜上所述，本研究結(jié)果提示：RA的發(fā)病在MBL-221和MBL-550多態(tài)位點不受年齡、性別和民族因素的影響。MBL-221位點的多態(tài)性變異可能與寧夏地區(qū)RA發(fā)生不相關，而MBL-550位點的多態(tài)性與寧夏RA發(fā)病關系更為密切，其變異等位基C可能是寧夏地區(qū)RA發(fā)生的危險因子。RA是一種復雜的由多種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的自身免疫性疾病，MBL作為機體天然免疫的第一道防線，其生物學功能的重要性已被充分肯定，個體MBL基因變異，MBL血清水平低下或功能缺損，從而導致補體凝集素途徑的活化不足，在明確MBL缺損后，用外源性MBL治療已顯示出臨床應用價值。本研究結(jié)果可為針對性地治療RA提供依據(jù)，并提示在臨床工作中基于不同的基因型采取相應的干預措施。而有關MBL途徑活化補體系統(tǒng)和免疫調(diào)控的機制、MBL與細胞受體識別并結(jié)合的機制和調(diào)節(jié)作用等問題，本課題組會在前期工作的基礎上做進一步的深入研究，以期可以對于RA的早期診斷、預防和治療提供思路。

參考文獻

[1]Doroti Pirulli，Michele Bonitto，Laura Vatta，et al.Polymorphisms in the promoter region and at codon 54 of the MBL2 gene are not associated with IgA nephropathy.[J].Nephrol Dial Transplant.2001，16：759-764.

[2]王艾麗等.甘露聚糖結(jié)合凝集素的生物學功能及其臨床意義.醫(yī)學研究生學報，2002，5：458-462.

[3]Presan is J，S KojimaM， Sim1 RB. Biochemistry and genetics of mannan-binding lectin（MBL）[J].Biochem Soc Trans，2003，31（4）：748-752.

[4]Koch A，Melbye M，Sorensen P，et al.Acute respiratory tract infection and mannose binding lectin insufficiency during early chindhood.[J ]Am Med Assoc，2001，285：1316-1321.

[5]Damon P. Eisen， Robyn M. Minchinton. Impact of Mannose-Binding Lectin on Susceptibility to Infectious Diseases. Clinical Infectious Diseases 2003， 37：1496–1505.

[4]Guo YL， Liu Y， Ban WJ， Sun Q， Shi GL.Association of mannose-binding lectin gene polymorphisms with the development of pulmonary tuberculosis in China.[J]BWC infectious Disrases，2017，17：210.

[5]Orsatti CL， Nahás EAP， Nahas-Netoa J， Orsatti FL， Linhares IM， Witkin SS， et al. Mannose-binding lectin gene polymorphism and risk factors for cardiovascular disease in postmenopausal women.？Mol Immunol.2014;61：23–27. doi： 10.1016/j.molimm.2014.05.003.

[6]Nisihara R，Skare T， et al.Mannose binding lectin deficiency and susceptibility to infections in patients with？rheumatoid arthritis.Rheumatology （Oxford）.2016 May;55（5）：951-2.

[7]Epp Boschmann S， Goeldner I， Tuon FF， et al.Mannose-binding lectin polymorphisms and？rheumatoid arthritis： A short review and meta-analysis.Mol Immunol.2016 Jan;69：77-85.

[8]Martiny FL，Veit TD，Brenol CV，et al.Mannose-binding lectin gene polymorphisms in Brazilian patients with rheumatoid arthritis.J Rheumatol. 2012 Jan;39（1）：6-9.

[9]Ip WK，Lau YL，Chan SY，et al.Mannose binding lectin and rheumatoid arthritis in southern Chinese.Arthritis Rheum，2000，43：1679-1687.

[10]Robin A. Liang，Ina I. H？iland.Plasma levels of mannose‐binding lectin and future risk of venous thromboembolism. J Thromb Haemost. 2019;17：1661-1669.