張衛(wèi)華, 劉思源, 華長(zhǎng)城

(1.永康市第一人民醫(yī)院 手外科，浙江 永康 321300； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 骨與軟組織腫瘤科，河北 石家莊 050051；3.亳州市人民醫(yī)院 骨科，安徽 亳州236800)

骨肉瘤在骨科惡性腫瘤中較為常見(jiàn)。骨肉瘤常用化療藥物包括氨甲喋呤、順鉑、阿霉素及異環(huán)磷酰胺等。骨肉瘤患者常對(duì)化療藥物耐藥，放化療效果欠佳，預(yù)后較差[1]。三氧化二砷是中藥砒霜的有效成分，我國(guó)學(xué)者應(yīng)用砷劑治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)，療效顯著[2]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)三氧化二砷治療骨肉瘤的研究較少，本研究旨在探討三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO)對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63的作用，以期對(duì)臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、Caspase-3酶原抗體及CyclinE均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，Bax、Bcl-2、CyclinD1均購(gòu)自SANTA公司，三氧化二砷購(gòu)自哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字：H19990191)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63為河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心凍存品。以含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 光鏡觀察 將MG-63細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分成對(duì)照組(不含藥物培養(yǎng)基)及實(shí)驗(yàn)組(含8 μmol/L ATO培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于倒置相差顯微鏡下，于24 h及36 h照相觀察其形態(tài)變化。

1.4 MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，將細(xì)胞調(diào)整為1.0×104/ mL，接種于96孔板，培養(yǎng)6～8 h，待細(xì)胞貼壁后用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)置對(duì)照組(不含藥培養(yǎng)基)，含不同濃度ATO組(10、8、6、4 μmol/L)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、36、48、60 h后，每孔加入MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO，37℃放置10～20 min，采用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)570 nm)測(cè)量吸光度，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=[1-(A加藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)]×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù) 將MG-63細(xì)胞接種在25 mL培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合，更換含不同濃度藥物的培養(yǎng)基作用36 h，每組3瓶。收集細(xì)胞，PBS洗滌，冰預(yù)冷的70%乙醇固定、離心，加入碘化丙啶室溫避光染色30 min, 用Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布。

1.6 蛋白印跡法 MG-63細(xì)胞經(jīng)藥物作用36 h后，收集細(xì)胞，每瓶細(xì)胞加100L含PMSF的裂解液(50 mmol/L Tris-Hcl pH7.4，1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L Nacl, 1 mmol/L PMSF)，于冰上裂解30 min后，4℃ 12 000 rpm，離心半徑10 cm 離心5 min。取上清移于-20℃保存。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。含10%小牛血清的TBST室溫下封閉1 h后，加入1.5%BSA稀釋的一抗PCNA(1∶500)、Cyclin D1(1∶200)、Cyclin E(1∶500)、Bcl-2(1∶200)、Bax (1∶1 000)、Caspase-3(1∶500)孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗4次后，加入1.5%BSA稀釋的二抗(1∶5 000)，孵育1 h。TBST洗4次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)2 min，檢測(cè)條帶并照相、分析、保存。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三氧化二砷對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 8 mol/L 三氧化二砷處理MG-63細(xì)胞24 h、36 h，細(xì)胞貼附能力減弱、漂浮細(xì)胞增多，并出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、體積變小、胞質(zhì)濃縮，最后破裂凋亡等變化。對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量多而完整、完全貼壁、胞質(zhì)均勻、狀態(tài)良好、無(wú)細(xì)胞破裂。見(jiàn)圖1。

2.2 三氧化二砷對(duì)MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 三氧化二砷可抑制MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng)，其效果與時(shí)間和濃度相關(guān)，見(jiàn)表1。三氧化二砷對(duì)MG-63細(xì)胞24、36、48、60 h的IC50分別為12.12、9.29、7.59、6.96 μmol/L。

表1 三氧化二砷對(duì)MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

A．對(duì)照組；B.8 μmol/L三氧化二砷，24 h; C.8 μmol/L三氧化二砷, 36 h

圖1 倒置顯微鏡觀察三氧化二砷作用下MG-63細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×100)

2.3 三氧化二砷對(duì)MG-63細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例(32.92±2.01)比較，4 μmol/L三氧化二砷組(12.53 ±1.18)、6 μmol/L三氧化二砷組(2.66±0.44)、8 μmol/L三氧化二砷組(15.13±0.71)、10 μmol/L三氧化二砷組(9.15±0.73)的G0/G1期細(xì)胞比例均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組S期細(xì)胞比例(42.45±1.44)比較，4 μmol/L三氧化二砷組(74.42±1.06)、6 μmol/L三氧化二砷組(72.93±1.07)、8 μmol/L三氧化二砷組(52.36±2.33)、10 μmol/L三氧化二砷組(81.48±1.56)的S期細(xì)胞比例均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 三氧化二砷對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組凋亡率(1.30±0.31)比較，4 μmol/L三氧化二砷組(2.79±0.22)、6 μmol/L三氧化二砷組(13.60±0.91)、8 μmol/L三氧化二砷組(9.58±0.84)、10 μmol/L三氧化二砷組(9.46±1.34)的凋亡率均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；三氧化二砷作用后各組細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡峰。見(jiàn)圖2。

A．對(duì)照組；B.4 μmol/L三氧化二砷; C.6 μmol/L三氧化二砷; D.8 μmol/L三氧化二砷; E. 10 μmol/L三氧化二砷。

2.5 三氧化二砷對(duì)MG-63細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，8 μmol/L 三氧化二砷組處理36 h后的PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

*與control組比較，P<0.05。

3 討論

骨肉瘤患者常存在肉眼難以察覺(jué)的細(xì)小轉(zhuǎn)移灶，單純手術(shù)不能解決所有問(wèn)題[3-5]。骨肉瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，一般預(yù)后較差[6]。新輔助化療理念是術(shù)前化療+手術(shù)+術(shù)后化療，強(qiáng)調(diào)術(shù)前化療6～10周使腫瘤局限，可使部分骨肉瘤患者實(shí)現(xiàn)保肢治療[7-8]。篩選有效的骨肉瘤化療藥物對(duì)于實(shí)施新輔助化療非常關(guān)鍵。

Chen等[9]研究表明，三氧化二砷可誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡和部分分化。大量研究表明[10-12]，除了對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用外，三氧化二砷對(duì)其他系統(tǒng)腫瘤也具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。郭衛(wèi)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷對(duì)Ⅲ期骨肉瘤、尤文肉瘤患者有較好的近期臨床療效。本研究結(jié)果表明，三氧化二砷對(duì)MG-63細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制具有劑量-時(shí)間效應(yīng)。Cyclin蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)的CDKS組成蛋白激酶復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的復(fù)制和增殖。Cyclin D在細(xì)胞周期中屬正性調(diào)節(jié)因子，過(guò)度的表達(dá)可激活CDK-4，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。細(xì)胞增殖的基因擴(kuò)增引起Cyclin E蛋白表達(dá)增強(qiáng)[15]。Cyclin D調(diào)節(jié)G1進(jìn)展，Cyclin E是實(shí)現(xiàn)G1/S轉(zhuǎn)換。本研究結(jié)果顯示，三氧化二砷將MG-63細(xì)胞阻滯于S期，提示三氧化二砷能干擾MG-63細(xì)胞的DNA合成及有絲分裂。

PCNA是細(xì)胞DNA合成所需蛋白，其表達(dá)、合成與細(xì)胞周期關(guān)系密切。PCNA在G1期合成增加，S期達(dá)到高峰。PCNA常作為測(cè)定細(xì)胞增殖水平的指標(biāo)，PCNA表達(dá)減少，表明細(xì)胞增殖受到抑制。Bcl-2家族是目前研究較多的凋亡相關(guān)基因家族，Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族， Bax/Bcl-2比值升高說(shuō)明促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bax/Bcl-2比值降低說(shuō)明抑制細(xì)胞凋亡。Caspase家族是實(shí)現(xiàn)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白，Caspase3處于Caspase家族完成細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的中心位置，是最主要的終末剪切酶，受上下游蛋白酶的調(diào)控。Caspase3表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，三氧化二砷下調(diào)MG-63細(xì)胞的PCNA、CyclinD1、CyclinE和Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。

綜上所述，三氧化二砷對(duì)體外MG-63細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，能下調(diào)PCNA、CyclinD、CyclinE和Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。