阿拉坦存布爾, 曹烏吉斯古楞, 包金花, 查蘇娜, 胡紅霞,王秀蘭

(1. 內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院,內(nèi)蒙古 通遼 028000;2. 內(nèi)蒙古民族大學/蒙醫(yī)藥研發(fā)工程教育部重點實驗室,內(nèi)蒙古 通遼 028000;3.內(nèi)蒙古民族大學農(nóng)學院,內(nèi)蒙古 通遼 028000)

【研究意義】手參[Gymnadeniaconopsea(L.) R. Br.]是蘭科(Orchidaceae)手參屬(Gymnadenia)地生多年生草本植物[1],蒙藥名為額日和藤乃嘎日,異名為旺拉嘎。手參入藥部位為塊莖,主要含有天麻素、手參多糖等成分[2-3],在蒙藥中具有補腎益精、生津止咳等功效[4]。在中藥中具有止咳平喘、益腎健脾、理氣和血等功效[5]。現(xiàn)代藥理學研究表明,手參具有改善記憶、神經(jīng)保護等藥理作用[2]。手參分布較廣,但由于手參藥材資源主要依賴野生資源,加之其自然繁殖效率低、亂采挖和自然生境被破壞等因素導致手參野生資源急劇減少,甚至面臨枯竭,目前已被《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》列為二級珍稀瀕危植物[6]。植物的生長與土壤環(huán)境因素密切相關,且受土壤微生物菌落影響,尤其是根際土壤微生物對植物的生長發(fā)育起重要作用[7-9]。因此,植物的分布與根際土壤微生物群落結(jié)構密切相關,進一步研究不同分布區(qū)手參根際土壤微生物群落結(jié)構及其與土壤環(huán)境因子的相關性為全面掌握手參生長特性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物根際是微生物最活躍的棲息地之一,也是微生物、植物和土壤相互作用和影響的重要場所[10]。根際微生物能促進土壤中有機質(zhì)分解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化[11-14],從而進一步調(diào)控藥用植物生長,影響其分布[15-17]。目前,已有西藏林芝、吉林長白山、河北五臺山地區(qū)分布的手參根際土壤微生物多樣性研究的報道。據(jù)統(tǒng)計,手參根際土壤真菌涵蓋栓菌屬(Trametes)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉菌屬(Penicillium)等43屬,不同地區(qū)手參根際土壤真菌群落結(jié)構均存在明顯差異[18-22],并且每個地區(qū)的優(yōu)勢類群各不同。粉褶菌科(Entolomataceae)為西藏手參根際土壤優(yōu)勢類群[20]。耙齒菌屬(Irpex)為吉林手參根際土壤真菌優(yōu)勢類群,鐮刀菌屬(Fusarium)為河北手參根際土壤真菌優(yōu)勢類群[18]。導致地區(qū)間手參根際土壤內(nèi)生真菌的差異可能與該植物生長環(huán)境因素相關。例如,西藏手參根際土壤內(nèi)生真菌特有屬較多,這可能與西藏地區(qū)高海拔有關,另外河北小五臺山地區(qū)土壤堿化程度高,而吉林長白山地區(qū)手參生境土壤偏酸性,除了海拔和土壤pH之外,與土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性、土壤含水量、坡度和雨水量都有密切相關[18,21]?，F(xiàn)已初步明確西藏、吉林、河北地區(qū)分布的手參根際土壤微生物中的優(yōu)勢類群,為揭示手參生長特性與土壤微生物群落結(jié)構相互關系奠定了一定的基礎[20,23]?！颈狙芯壳腥朦c】通過 Illumina MiSeq 高通量測序技術,以內(nèi)蒙古不同分布區(qū)手參的根際土壤為研究對象,對根際微生物的群落組成和分布規(guī)律進行分析比較?！緮M解決的關鍵問題】進一步探究手參根際土壤真菌組成與土壤環(huán)境因子的相關性,為掌握手參生長特性及其人工栽培、生態(tài)種植等資源保護及可持續(xù)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 手參根際土壤的采集

于2022年7月,從內(nèi)蒙古阿魯科爾沁旗(A1)、翁牛特旗(W2)、東烏珠穆沁旗(D3)3個分布區(qū)采集手參根際土壤樣本(表1)。隨機選取不同手參植株根際10～20 cm 土層處土壤,每間隔10～50 m選擇1株手參,共取6株手參土壤樣品,過孔徑為2 mm篩去除雜草根系,裝入無菌袋中,3個分布區(qū)共收集18份樣品,帶回實驗室用于土壤理化性質(zhì)檢測和高通量測序。

表1 手參根際土壤采樣地點及信息

1.2 手參根際土壤的理化性質(zhì)測定

根據(jù)鮑士旦[24]的方法測定土壤總氮、總磷、總鉀、速效鉀、有效磷、有機質(zhì)、水分、pH和堿解氮9項理化性質(zhì)。每個樣品重復6次。

1.3 方法

1.3.1 手參根際土壤微生物DNA提取 選用PowerSoilDNAIsolationKit試劑盒,根據(jù)說明書提取手參根際土壤微生物總DNA,利用NanoDropOne檢測DNA的濃度和純度。

1.3.2 手參根際土壤微生物總DNA的PCR擴增和高通量測序 以提取的手參根際土壤微生物總DNA為模板,對基因組ITS1～ITS2區(qū)域進行擴增。采用真菌ITS區(qū)的特異性引物(ITS1F:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’; ITS2:5’-GCTGCGTTCTT CATCGATGC-3’)進行 PCR擴增,反應程序為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,45 ℃ 20 s,65 ℃ 30 s,5 個循環(huán);94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,20 個循環(huán);72 ℃ 5 min;10 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,合格產(chǎn)物用天根膠回收試劑盒進行回收純化后進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 測序數(shù)據(jù)處理及OTU特征分析 利用overlap將雙端數(shù)據(jù)進行拼接,并進行質(zhì)控、嵌合體過濾,獲得高質(zhì)量的CleanData。QIIME2修正擴增子的測序,獲得單堿基精度的代表序列,使用ASVs (Amplicon sequence variants)的概念構建類OTU(Operational taxonomic units)表,獲得最終的OTUs特征表以及特征序列,進一步進行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等。

1.4.2 手參根際土壤真菌群落多樣性和結(jié)構分析 基于OTUs特征序列統(tǒng)計結(jié)果,使用QIIME2軟件包中的各種腳本進行Alpha多樣性和Beta多樣性分析,其中Alpha多樣性通過Chaol指數(shù)、Observed species指數(shù)、Goods_coverage指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)來反映樣品多樣性和豐富度。Beta多樣性分析通過非加權組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic,UPGMA)獲得聚類樹和主坐標分析(Principal coordinates analysis,PCoA)。再利 用 R 軟 件 的 冗 余 分 析(Redundancy analysis,RDA)對手參根際土壤真菌、土壤環(huán)境因子以及分布區(qū)三者間進行分析,同時用Spearman相關性對根際土壤真菌群落豐度與土壤環(huán)境因子進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 手參根際土壤的理化性質(zhì)

從表2可知,手參根際土壤pH在各分布區(qū)無顯著差異,均呈酸性,pH 5.97～6.06。依據(jù)全國第二次土壤普查養(yǎng)分分級標準[25],有機質(zhì)含量在阿魯科爾沁和翁牛特分布區(qū)達Ⅲ級,為最適水平;全鱗含量在翁牛特分布區(qū)達Ⅰ級,為極豐富水平;全鉀含量在東烏珠穆沁分布區(qū)處于Ⅰ級,為極豐富水平;堿解氮和速效鉀含量在阿魯科爾沁和翁牛特分布區(qū)均達到Ⅰ或Ⅱ級,為極豐富或豐富水平;有效磷含量在3個分布區(qū)均處于Ⅱ級,為豐富水平;全氮含量在3個分布區(qū)均處于Ⅵ,為極缺乏水平。表明,3個分布區(qū)的手參根際土壤具有不同的理化性質(zhì)特征。

表2 不同分布區(qū)手參根際土壤的理化性質(zhì)

2.2 手參根際土壤真菌測序數(shù)據(jù)

經(jīng) Illumina Miseq 高通量測序后,3個分布區(qū)的土樣中共生1495 852條優(yōu)化序列,有效數(shù)據(jù)中數(shù)據(jù)質(zhì)量≥Q20的數(shù)據(jù)平均比例為99.28%,有效數(shù)據(jù)中數(shù)據(jù)質(zhì)量≥Q30的數(shù)據(jù)平均比例為97.44%,有效數(shù)據(jù)中數(shù)據(jù)GC平均含量為50.13%(表3)?；?7%相似度水平下,共聚成5125個OTUs。從圖 1可知,3個分布區(qū)A1、W2和D3共有OTUs數(shù)目為203;每個樣品存在不同數(shù)量的特有 OTUs,其中A1特有OTUs數(shù)目為1796,W2特有OTUs數(shù)目為1125,D3特有OTUs數(shù)目為1427。說明東烏珠穆沁旗手參根際土真菌組成與另兩個地區(qū)相比特有群落更明顯。

表3 手參根際土壤真菌ITS測序結(jié)果

圖1 不同分布區(qū)手參根際土壤樣品OTUsFig.1 OTUs of rhizosphere soil samples of G.conopsea from different distribution areas

2.3 不同分布區(qū)手參根際土壤真菌Alpha多樣性

從圖 2可知,隨著A1、W2和D3的3組18個樣品測序數(shù)量的增多,Alpha 多樣性指數(shù)值變化越來越緩慢,當達到足夠數(shù)量后,曲線逐漸趨于平緩,表明測序深度能夠覆蓋樣品根際土壤中的所有真菌微生物。

圖2 手參根際土壤樣品的稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of rhizosphere soil sample of G.conopsea

從表4可知,A1、W2、和D3的3組18個樣品的覆蓋度均為 1.0,表明測序結(jié)果達到飽和狀態(tài),能夠覆蓋所有真菌類群。在所有樣品中,阿魯科爾沁旗手參根際土壤的OTUs指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均最高,其次為東烏珠穆沁旗,翁牛特旗中所有指數(shù)均最低,表明阿魯科爾沁旗的手參根際土壤真菌群落多樣性和豐度最高,翁牛特旗中的最低。A1和D3的Chao1 指數(shù)均與W2的顯著差異,表明阿魯科爾沁旗和東烏珠穆沁旗的手參根際土壤真菌物種數(shù)量均與翁牛特旗顯著差異。

表4 手參根際土壤真菌群落Alpha多樣性分析

2.4 不同分布區(qū)手參根際土壤真菌Beta多樣性分析

基于各樣品的OTUs分析結(jié)果,UPGMA 層次聚類分析(圖 3)顯示,翁牛特旗(WD)和東烏珠穆沁旗(DW)分布區(qū)的根際土壤真菌群落組成較相似,阿魯科爾沁旗(AQ)的根際土壤真菌群落組與其他2個分布區(qū)的土壤真菌組成差異較大。NMDS分析表明,不同分布區(qū)的土壤樣品具有一定的分組意義。ANOSIM分析(圖4)表明,組間的差異顯著大于組內(nèi)差異(R=0.601,P=0.001)?；诜羌訖郩nifrac距離算法下手參根際土壤真菌在屬水平上的PCoA (Principal co-ordinates analysis)結(jié)果(圖5)顯示,3個分布區(qū)的樣品均能被明顯區(qū)分,說明3個分布區(qū)手參的根際土壤真群落組成存在一定差異。

圖3 基于非加權unifrac距離算法下手參根際土壤真菌在ASV分析上的UPGMA聚類樹Fig.3 UPGMA cluster tree of G. conopsea rhizosphere soil fungi on ASV analysis based on unweighted unifrac distance algorithm

2.5 不同分布區(qū)手參根際土壤真菌的群落組成

3個分布區(qū)手參根際土壤真菌測序所獲得的5125個OTUs隸屬于11門、31綱、65目、161科、158屬(表5)。從門水平看,在豐度前30的物種分類中,除未能分類到屬的真菌類群外,3個分布區(qū)有10個共有門,其中被孢霉菌門(Mortierellomycota)為阿魯科爾沁旗(A1)的特有門(圖6)。子囊菌門和擔子菌門在阿魯科爾沁旗(A1)中的相對豐度分別為45.3%和31.77%,在翁牛特旗(W2)中的相對豐度分別為24.4%和62.06%,在東烏株穆沁旗(D3)中的相對豐度分別為61.23%和24.91%,認為是手參根際土壤真菌優(yōu)勢門。

在屬水平上,在豐度前30的屬中,被孢霉屬(Mortierella)、濕傘屬(Hygrocybe)、珊瑚菌屬(Clavaria)、毛舌菌屬(Trichoglossum)、外瓶霉屬(Exophi-ala)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、擬鎖瑚菌屬(Cla-vulinopsis)、肉座菌屬(Hypocrea)、小菇屬(Mycena)等29屬是3個分布區(qū)的共有屬,只有Myxarium是阿魯科爾沁旗(A1)的特有屬(圖7)。其中,被孢霉屬、濕傘屬、毛舌菌屬、外瓶霉屬和珊瑚菌屬等5個屬豐度最高(圖8),并且不同分布區(qū)的豐度最高的屬各不相同,例如,阿魯科爾沁旗(A1)豐度最高的屬為被孢霉屬(18.81%),翁牛特旗(W2)豐度最高的屬為濕傘屬(23.68%),東烏旗(D3)豐度最高的屬為毛舌菌屬(15.29%)。

圖4 基于非加權unifrac距離算法下手參根際土壤真菌在屬水平上的NMDS分析Fig.4 NMDS analysis of G. conopsea rhizosphere soil fungi at genus level

圖5 基于非加權unifrac距離算法下手參根際土壤真菌在屬水平上的主坐標分析Fig.5 PCoA analysis of G. conopsea rhizosphere soil fungi at genus level based on unweighted unifrac distance alogorithm

表5 手參根際土壤真菌在不同分類水平上的數(shù)目

圖6 手參根際土壤真菌在門水平上的群落組成Fig.6 The composition of the producing area of G. conopsea rhizosphere soil fungi at the phylum level

2.6 不同分布區(qū)手參根際土壤真菌的物種差異

對屬水平的所有物種進行差異分析,篩選P值小于0.05的前15物種繪制柱狀圖(圖9),除未能分類到屬的真菌類群外,在阿魯科爾沁旗(A1)中Cladophialophora、Neonectria、隱球酵母屬、Gibberella、鐮刀菌屬、Camarophyllopsis、Glomerella屬類的豐富度顯著高于其他分布區(qū);在翁牛特旗(W2)中濕傘屬、擬鎖瑚菌屬、Hymenogaster屬的豐富度顯著高于其他分布區(qū):在東烏珠穆沁旗(D3)中,毛舌菌屬、土赤殼屬、Nectria、Hemileucoglossum、Cylindrocarpon、Paraconiothyrium、Minutisphaera、Scutellinia、Cosmospora等屬的豐富度顯著高于A1和W2。

圖7 手參根際土壤真菌在屬水平上的組成Fig.7 The composition of producing area of G. conopsea rhizosphere soil fungi at genus level

圖8 手參根際土壤真菌豐度前10的屬Fig.8 The top 10 genera of fungi abundance in rhizosphere soil of G. conopsea

圖9 手參根際土壤真菌的物種差異分析Fig.9 Differential species analysis of fungi in the rhizosphere soil of G. conopsea

2.7 不同分布區(qū)手參根際土壤真菌與土壤環(huán)境因子的相關性分析

對手參根際土壤樣品中相對豐度前 15 位的真菌菌屬與土壤環(huán)境因子(圖10)進行RDA分析,第1和第2軸的解釋率分別為21.59%和13.40%,累計總解釋率達 33.99%,表明該結(jié)果能夠反映真菌群落與土壤環(huán)境因子之間的相互關系。土壤環(huán)境因子對手參根際土壤真菌群落的影響依次為:全磷>全鉀>速效鉀>土壤水分>全氮>pH>堿解氮>有效磷。Spearman相關分析(圖11)表明,Knufia、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬、Cladophialophora與速效鉀呈正相關;被孢霉屬和鐮刀菌屬與堿解氮呈正相關;肉座菌屬、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬、Cladophialophora與有效磷呈正相關;濕傘屬、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬與有機質(zhì)呈正相關,而肉座菌屬、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬、Cladophialophora與有機質(zhì)呈負相關;鐮刀菌屬與全氮呈負相關;濕傘屬和鎖瑚菌屬與全磷呈正相關,而鐮刀菌屬與全氮呈負相關;濕傘屬、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬與土壤水分呈正相關。Myxarium屬與速效鉀和有效磷呈正相關;毛舌菌屬與pH和全鉀呈正相關,而與有效磷、速效鉀、全磷、有機質(zhì)、土壤水分呈負相關。綜上所述,土壤全磷、全鉀、全氮及水分可能是影響手參根際土壤真菌群落組成的主要因子。

OM:有機質(zhì);TN:全氮;TP:全磷;TK:全鉀;AN:堿解氮;AP:有效磷;AK:速效鉀;PH:酸堿度;W:水分。箭頭長短代表其與真菌的關聯(lián)程度;箭頭間夾角為銳角代表正相關,夾角為鈍角代表負相關性,夾角為直角表示無相關性。OM:Organic matter;TN:Total nitrogen;TP:Total phosphorus;TK:Total potassium;AN:Alkali hydrolyzed nitrogen;AP:Available phosphorus;AK:Available potassium;W:Moisture content;The length of the arrow represents the degree of association with fungi;The acute angle,obtuse angle and right angle between the arrows represent the positive correlation,negative correlation and no correlation,respectively.

*表示相關在P<0.05水平顯著。* mean significant correlation at P<0.05 level.

3 討 論

本研究基于高通量測序?qū)?nèi)蒙古3個分布區(qū)手參根際土壤真菌群落組成及多樣性進行研究,并與土壤環(huán)境因子進行相關性分析。內(nèi)蒙古不同分布區(qū)手參根際土壤真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)總體趨勢表現(xiàn)為 A1>D3>W2,表明不同分布區(qū)手參根際土壤真菌群落存在一定差異;在門水平上,子囊菌門和擔子菌門是手參根際土壤真菌優(yōu)勢類群,這與大多數(shù)蘭科植物優(yōu)勢類群研究一致[26-27],說明子囊菌門和擔子菌門真菌在一些蘭科植物的土壤中具有普遍性。子囊菌門的群落構成主要為腐生菌,分泌多種不同酶,將土壤中難降解的有機質(zhì)分解為二氧化碳、無機鹽和簡單有機物等,在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起重要作用[28]。在屬水平上,3個分布區(qū)中被孢霉屬、濕傘屬、毛舌菌屬為豐富度最高的共有屬,Myxarium屬為阿魯科爾沁旗特有屬,認為被孢霉屬、濕傘屬、毛舌菌屬是手參根際土壤真菌優(yōu)勢類群。本研究發(fā)現(xiàn)的內(nèi)蒙古分布區(qū)手參根際土壤真菌優(yōu)勢類群與其他分布區(qū)明顯不同[20,23]。

Knufia、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬、Cladophialophora與速效鉀呈正相關;被孢霉屬和鐮刀菌屬與堿解氮呈正相關;肉座菌屬、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬、Cladophialophora與有效磷呈正相關;濕傘屬、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬與有機質(zhì)呈正相關,而肉座菌屬、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬、Cladophialophora呈負相關;鐮刀菌屬與全氮呈負相關;濕傘屬和鎖瑚菌屬與全磷呈正相關,而鐮刀菌屬呈負相關;濕傘屬、外瓶霉屬、鎖瑚菌屬與土壤水分呈正相關。Myxarium屬與速效鉀和有效磷呈正相關,是阿魯科爾沁分布區(qū)的特有屬,該分布區(qū)中的土壤速效鉀和有效磷含量顯著大于其他分布區(qū),表明Myxarium屬的豐富度大小與土壤理化條件有關系。另外,毛舌菌屬是東烏旗豐富度最高的屬,毛舌菌屬與pH和全鉀呈正相關;而與有效磷、速效鉀、全磷、有機質(zhì)、土壤水分呈負相關,在東烏旗中土壤pH和全鉀含量與其他分布區(qū)相比較高;而土壤有效磷、速效鉀、全磷、有機質(zhì)、土壤水分的含量相比較低,說明土壤營養(yǎng)元素含量程度會影響毛舌菌屬在手參根際土壤中的豐富度高低程度。濕傘屬是翁牛特旗豐富度最高的屬,濕傘屬與全磷、有機質(zhì)和水分呈正相關,但翁牛特旗的土壤全磷、有機質(zhì)和水分含量與其他分布區(qū)相比較高;被孢霉屬是阿魯科爾沁旗豐富度最高的屬,它與堿解氮呈正相關,但該分布區(qū)的土壤堿解氮含量相比較高,說明被孢霉屬和濕傘屬在手參根際土壤真菌群落中的豐富度不受土壤營養(yǎng)元素含量大小變化。本研究中,3個分布區(qū)的手參生長地理位置不同,海拔和生境等環(huán)境也不同,其主要分布在海拔891～1260 m的草甸、山坡林下、林間草地中。陳冉等[29]研究發(fā)現(xiàn),根際微生物群落多樣性不僅與土壤條件有關也與地區(qū)因素關系密切,主要受生態(tài)區(qū)的氣候和地理位置影響[18,26]。肉座菌屬和鐮刀菌屬是土壤中常見的致病菌[30-31],土壤中長期并大量存在以上菌屬時,導致植物養(yǎng)分獲取不足,生長力及抗病性下降,引起土壤中病原菌的侵害[32],表明這2個屬在手參根際土壤真菌群落中的豐富度大小對手參生長發(fā)育具有潛在影響。鐮刀菌屬與堿解氮呈正相關,與全磷和全氮呈負相關;肉座菌屬與有效磷呈正相關,與有機質(zhì)呈負相關。因此,及時關注土壤營養(yǎng)元素變化、調(diào)控土壤中有機質(zhì)及氮磷元素含量可能成為影響手參生長及預防病害的有效途徑。

4 結(jié) 論

土壤全磷、全鉀、全氮及水分可能是影響手參根際土壤真菌群落組成的驅(qū)動因子。本研究結(jié)果初步了解到內(nèi)蒙古地區(qū)分布的手參生長土壤條件,根際土壤真菌群落特征,為手參根際土壤真菌與土壤環(huán)境因子相關性研究提供了新的結(jié)論,并可通過調(diào)控土壤環(huán)境因子進行人工栽培、生態(tài)種植等資源保護及可持續(xù)利用奠定了科學研究基礎。