李億，秦艷，申乃坤，朱婧，梁戈，王青艷*

1(廣西科學(xué)院，國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，非糧生物質(zhì)酶解國家重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西生物質(zhì)工程技術(shù)研究中心， 廣西 南寧， 530007)2(廣西民族大學(xué) 海洋科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣西微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗室， 廣西 南寧， 530008)

丙酮酸及其鹽作為一類重要的平臺化合物，在農(nóng)用化學(xué)品、聚合物、化妝品、食品添加劑、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用[1-2]。例如，丙酮酸及其鹽是合成丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸、二羥苯基丙氨酸(用于治療帕金森疾病)等貴重化合物的關(guān)鍵底物[2-3]；最近的臨床研究表明，丙酮酸能有效治療和預(yù)防與碳水化合物、脂肪和能量代謝紊亂(壓力、肥胖、糖尿病、心血管疾病等)有關(guān)的疾病[3]。傳統(tǒng)的丙酮酸生產(chǎn)通常采用化學(xué)法，該法雖然操作簡單，但也存在成本較高，產(chǎn)率低、污染環(huán)境等明顯缺點(diǎn)[4]；相比之下，微生物發(fā)酵法因具有以可再生生物質(zhì)為底物、成本低廉、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品具有高純度等優(yōu)點(diǎn)[5]，更具市場競爭優(yōu)勢。

目前，丙酮酸發(fā)酵菌株研究最多的主要有多種維生素營養(yǎng)缺陷型光滑念珠菌(Candidaglabrata，之前稱為Torulopsisglabrata)[6-7]、硫辛酸營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌(Escherichiacoli)[8-9]工程菌株。然而，由于T.glabrata和E.coli具有條件致病性[10-11]，很大程度上限制其應(yīng)用范圍。相比之下，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)因具有長期用于食品與釀造等領(lǐng)域，被認(rèn)證為GRAS(generally regarded as safe)微生物，發(fā)酵產(chǎn)品具有安全性；遺傳背景清晰，有著較為完善的遺傳優(yōu)化工具，便于遺傳改造操作；能耐受低pH條件，可減少酸性產(chǎn)品的中和需求，有利于下游產(chǎn)品處理；抗?jié)B透性強(qiáng)，能耐受高濃度的產(chǎn)物和底物[12]等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是丙酮酸生產(chǎn)的潛在最適菌株之一，已引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

然而，由于S.cerevisiae糖酵解過程產(chǎn)生的丙酮酸在胞質(zhì)內(nèi)的丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)催化作用下會迅速裂解為CO2和乙醛[13]，造成自身無法大量積累丙酮酸。因此，要實(shí)現(xiàn)S.cerevisiae大量積累丙酮酸，減弱丙酮酸的降解途徑是關(guān)鍵。減弱丙酮酸的降解途徑最直接的方法就是失活PDC，該酶受3個結(jié)構(gòu)基因(pdc1、pdc5、pdc6)表達(dá)調(diào)控。同時敲除這3個結(jié)構(gòu)基因會導(dǎo)致工程菌株無法在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，但通過長期進(jìn)化能獲得可利用葡萄糖積累丙酮酸的菌株[14-15]。

適應(yīng)性進(jìn)化又稱進(jìn)化工程，是一種通過模擬自然進(jìn)化中的變異和選擇過程，在人工選擇的壓力下實(shí)現(xiàn)微生物的進(jìn)化，最后從進(jìn)化菌群中篩選出優(yōu)良性狀的菌種改良技術(shù)[16-17]。該技術(shù)能夠驅(qū)使微生物種群或單細(xì)胞微生物在較短的時間內(nèi)，為適應(yīng)環(huán)境的變化，自身的DNA/RNA堿基或基因組結(jié)構(gòu)等自發(fā)產(chǎn)生突變[17-18]。適應(yīng)性進(jìn)化不像基因工程那樣對微生物遺傳背景有很強(qiáng)的依賴性，因此該技術(shù)尤其適合對生理特性缺乏了解的菌種以及復(fù)雜性狀的選育。目前實(shí)驗室最常用的適應(yīng)進(jìn)化方法是在特定條件(給予選擇壓力)下將微生物連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過菌株自發(fā)突變的不斷積累，獲得適應(yīng)特定條件的表型或生理性能。

本研究以1株工業(yè)釀酒酵母XY-49為出發(fā)菌株，利用Cre/loxp同源重組方法敲除其丙酮酸脫羧酶基因(pdc1、pdc5、pdc6)，削弱或阻斷乙醇合成途徑，從而實(shí)現(xiàn)丙酮酸的積累；同時采用葡萄糖適應(yīng)性定向進(jìn)化策略對突變菌株進(jìn)行傳代馴化培養(yǎng)，以期篩選到葡萄糖耐受度高、菌體生長速度快、丙酮酸高效積累的工程菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所使用的釀酒酵母菌株如表1所示；敲除組件質(zhì)粒pUG6、篩選標(biāo)記回收質(zhì)粒pSH65，均由本實(shí)驗室自存。

表1 本研究所用的釀酒酵母菌株Table 1 S. cerevisiae strains used in the present study

1.1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI公布的釀酒酵母pdc1、pdc5和pdc6基因堿基序列，設(shè)計了表2中的PCR引物，所有引物均由上海Invitrogen公司合成。

表2 PCR引物Table 2 Primers used in PCR

注：下劃線部分代表目標(biāo)基因的同源臂序列

1.1.3 酶與試劑

LATaqDNA聚合酶及其相關(guān)試劑,TaKaRa公司；乙醇脫氫酶、遺傳霉素(G418),索萊寶生物科技有限公司；博萊霉素(Zeocin),invitrogen公司；其余試劑為進(jìn)口分裝或者國產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母粉 10，葡萄糖 20，pH自然，121℃ 滅菌20 min。

YPE培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 20，酵母粉 10，乙醇 2%(體積分?jǐn)?shù))，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

SD培養(yǎng)基(g/L)：酵母氮源(YNB) 6.7，(NH4)2SO45，葡萄糖 20，無菌0.22 μm濾膜除菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：初始葡萄糖80～100，酵母粉 10，胰蛋白胨 10，K2SO46，KH2PO43，MgSO40.5，金屬離子母液 10 mL/L，115 ℃，滅菌20 min。其中，糖與其他成分分開滅菌。

金屬離子母液(g/L)[19]：EDTA 1.5，ZnSO4·7H2O 0.45，CoCl2·6H2O 0.03，MnCl2·4H2O 0.1，CuSO4·4H2O 0.03，CaCl2·2H2O 0.45，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3 g/L，NaMoO4·2H2O 0.04，H3BO40.1，KI 0.01。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 基因敲除

以XY-49為出發(fā)菌株，參照文獻(xiàn)[20]的方法分離制備其MATa和MATα兩型單倍體細(xì)胞，然后以質(zhì)粒pUG6為模版，使用引物A和B(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為 95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1.8 min，30個循環(huán)；72℃、10 min。獲得的敲除組件片段含有目的基因上下游同源序列、loxp位點(diǎn)以及kamX抗性篩選標(biāo)記。PEG/LiAc法分別轉(zhuǎn)化兩種配型單倍體細(xì)胞(MATa型和MATα型)，再分別涂布到含300 μg/mL G418的YPD(或YPE)平板上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取克隆子進(jìn)行擴(kuò)培后提取基因組，以此為模版，使用引物F和R(表2)進(jìn)行驗證。PCR條件為95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min，30個循環(huán)；72 ℃、10 min。將質(zhì)粒pSH65轉(zhuǎn)化到陽性克隆子中，半乳糖誘導(dǎo)切除kamX抗性篩選標(biāo)記，通過至少12次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)移除pSH65，獲得陽性克隆子。本文遵循pdc6→pdc5→pdc1的次序重復(fù)以上過程將上述基因逐個敲除。

1.2.2 MATa型和MATα型單倍體雜交復(fù)倍

參照文獻(xiàn)[21]的方法，將1.2.1步驟中得到的具有相同基因突變類型的單倍體(MATa型和MATα型)進(jìn)行雜交復(fù)倍，得到相應(yīng)的二倍體菌株(表1)。

1.2.3 酶活檢測

粗酶提?。簩⑨劸平湍讣?xì)胞接入100 mL YPD(含80 g/L 葡萄糖)培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期，然后12 000 r/min離心1 min收集細(xì)胞，用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)清洗2次，懸浮并置于-20 ℃?zhèn)溆茫粰z測前用20 mL、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)重懸，并加入1 mmol/L DTT，冰上冷凍5 min后在超聲波儀(輸出功率為200 W)中超聲5 s，冰上間隔冷卻1 min，重復(fù)過程15次。4 ℃、36 000×g條件下離心20 min，取上清即細(xì)胞提取物置于冰上，隨即用于酶活的檢測[22]。總蛋白量以考馬斯亮藍(lán)法[23]測定。

丙酮酸脫羧酶反應(yīng)混合液每1 mL包含40 mmol/L咪唑鹽酸緩沖液，0.2 mmol/L硫胺素焦磷酸，0.15 mmol/L NADH，乙醇脫氫酶88 U/mL，5 mmol/L MgCl2，20 μL細(xì)胞破碎上清液，反應(yīng)起始于50 mmol/L丙酮酸鉀的加入，并在30 ℃，pH 7.4條件下，測定OD340處的吸光度變化[19]。每分鐘催化1 μmol NADH氧化所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。比酶活(U/mg)定義為每mg總蛋白所含有的酶活。

1.2.4pdc三重缺失突變株的葡萄糖適應(yīng)性進(jìn)化

針對pdc缺失突變株無法利用葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行批次發(fā)酵的問題，本文參照文獻(xiàn)[24]報道的方法對目標(biāo)突變株進(jìn)行了葡萄糖適應(yīng)性定向進(jìn)化篩選，以改善突變株的細(xì)胞生長及葡萄糖利用等生理指標(biāo)。

1.2.5 突變菌株的生理特性試驗

從-80 ℃冰箱取出菌株在YPE(含2%乙醇)平板上劃線活化，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；挑取活化的單菌落接到5 mL液體YPE(含體積分?jǐn)?shù)為2%乙醇)培養(yǎng)基中，30 ℃、 220 r/min培養(yǎng)2 d； 5 000 r/min、 離心5 min，棄掉上清液，用5 mL無菌水重懸；測定菌體的OD600值，接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(含80 g/L葡萄糖)的250 mL三角瓶中，使發(fā)酵初始OD600≈0.2，30 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)96 h。

1.2.6 2 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：將突變菌株XY-156A接入YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h，種子連續(xù)活化2次。發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按照體積分?jǐn)?shù)為10%的比例接入2 L發(fā)酵罐(上海百倫科技)，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為1 L，發(fā)酵溫度設(shè)為30 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，通氣速率為0.75 L/min，在發(fā)酵過程中使用10 mol/L KOH自動維持pH=4.5。

1.2.7 分析方法

生物量測定：取0.5 mL菌液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，利用Beckman coulter UV 800 紫外可見分光光度計在波長為 600 nm 條件下測定菌體濃度。

代謝產(chǎn)物分析：代謝產(chǎn)物采用高效液相色譜儀(戴安Ultimate 3000)分析，丙酮酸用紫外檢測器(ultraviolet absorption detector,UV)檢測，檢測波長為210 nm；乙醇用視差檢測器(refractive index detecor,RI)檢測，色譜柱為Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid H+(8%)(300 mm×7.8 mm)，流動相為2.5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫50 ℃。葡萄糖測定采用SBA-40D生物傳感分析儀。

2 結(jié)果與分析

2.1 pdc基因敲除轉(zhuǎn)化子的驗證結(jié)果

從G418抗性平板上挑取陽性克隆子，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取基因組DNA作為模版，以對應(yīng)配型的親本菌株(MATa型和MATα)為對照，分別以P6-F/P6-R、P5-F/P5-R和P1-F/P1-R(表2)為引物進(jìn)行PCR全長驗證，如圖1所示，對照擴(kuò)增出2.4 kb左右大小的pdc6基因片段，轉(zhuǎn)化子則擴(kuò)增出大小約為2.0 kb的基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符，證明pdc6基因敲除組件片段已成功置換pdc6基因的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，pdc6基因被敲除。同理，如圖2和圖3所示，證明pdc5和pdc1基因敲除組件片段已成功置換各自的ORF區(qū)域，pdc5和pdc1基因被敲除。

M,DL5000DNA marker;1，缺失開放閱讀框的pdc6基因的PCR產(chǎn)物；2，pdc6基因的PCR產(chǎn)物圖1 基因pdc6突變子PCR驗證Fig.1 PCR verification of gene pdc6 mutant

M,DL5000DNA marker;1，缺失開放閱讀框的pdc5基因的PCR產(chǎn)物；2，pdc5基因的PCR產(chǎn)物圖2 基因pdc5突變子PCR驗證Fig.2 PCR verification of gene pdc5 mutant

M,DL5000DNA marker;1，缺失開放閱讀框的pdc1基因的PCR產(chǎn)物；2，pdc1基因的PCR產(chǎn)物圖3 基因pdc1突變子PCR驗證Fig.3 PCR verification of gene pdc1 mutant

2.2 PDC酶活的檢測分析

按照1.2.3的方法，進(jìn)一步通過測定突變株的PDC酶活，以最終確定pdc三個等位基因被敲除，結(jié)果如表3所示。由表3可知，當(dāng)釀酒酵母的pdc6基因缺失后，其比酶活為原始菌株的92%；當(dāng)pdc5和pdc6同時缺失之后，其比酶活為原始菌株的86%；當(dāng)pdc1、pdc5和pdc6同時缺失之后，其比酶活為原來的0.3%，說明pdc3個等位基因已成功缺失。

表3 突變菌株丙酮酸脫羧酶比酶活Table 3 Specific pyruvate decarboxylase activity of wild-type and pdc mutant strains

2.3 突變菌株的生理特性發(fā)酵試驗

細(xì)胞生長及耗糖情況的測定：搖瓶液體平行培養(yǎng)XY-49、XY-6、XY-56、XY-156和XY-156A菌株，測定整個生長過程的菌體生物量(OD600)及耗糖情況，結(jié)果如圖4所示。pdc6單獨(dú)缺失，菌體生長、葡萄糖消耗速率幾乎不受影響；pdc5和pdc6雙基因缺失對其葡萄糖消耗速率影響很小，但其菌體生物量相比原始菌株稍有降低；pdc1、pdc5和pdc6三基因缺失后，突變株(XY-156)生長延滯期變長，對數(shù)期較短，發(fā)酵進(jìn)行到60 h時，其生物量(OD600)為2.21±0.12，較野生菌株XY-49下降了86%。此時，突變株XY-156葡萄糖消耗了(14.55±1.02) g/L，野生菌株消耗了(79.3±1.2) g/L，表明pdc三個等位基因缺失之后，菌株的生長、葡萄糖消耗受到了較為強(qiáng)烈的影響。

A-細(xì)胞生長；B-葡萄糖消耗圖4 不同突變菌株的細(xì)胞生長和葡萄糖消耗情況Fig.4 Cell growth and glucose consumption of different mutant strains

突變菌株產(chǎn)乙醇、丙酮酸情況的測定：在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，定期取樣檢測發(fā)酵液中乙醇、丙酮酸的含量，考察pdc基因缺失對其主要代謝產(chǎn)物(乙醇、丙酮酸)合成的影響，結(jié)果如表4所示。當(dāng)pdc6單基因缺失或pdc5和pdc6雙基因缺失時，獲得的突變菌株(XY-6、XY-56)與對照菌株XY-49相比，乙醇合成幾乎不受影響，丙酮酸積累量很低；而當(dāng)pdc1、pdc5和pdc6三基因缺失以后，突變菌株XY-156的丙酮酸積累量較對照菌株XY-49有了大幅提升，發(fā)酵過程中沒有乙醇產(chǎn)生。

表4 突變菌株主要代謝產(chǎn)物的檢測 單位：g/LTable 4 Determination of main metabolites of different mutant strains

結(jié)合表3、表4和圖4可知，pdc6單獨(dú)缺失或pdc5和pdc6同時缺失對細(xì)胞生長、葡萄糖利用、乙醇以及丙酮酸積累影響不大，說明pdc5、pdc6在PDC表達(dá)中不起主導(dǎo)作用，這與文獻(xiàn)[19]報道一致。同時敲除pdc1、pdc5和pdc6，可完全消除乙醇并實(shí)現(xiàn)丙酮酸積累，但同時也導(dǎo)致了突變菌株XY-156對葡萄糖敏感、細(xì)胞生長緩慢。這是由于pdc基因缺失以后，胞質(zhì)內(nèi)缺少乙酰-CoA(由PDC酶催化丙酮酸脫羧而來)供應(yīng)，脂質(zhì)、賴氨酸的生物合成過程受阻所致[15]。此外，由圖4和表4可知，雖然進(jìn)化突變菌株XY-156A的生物量和糖耗速率仍不及原始菌株XY-49，但與進(jìn)化前菌株XY-156相比，其在細(xì)胞生物量、丙酮酸積累、葡萄糖耐受及消耗速率方面均有顯著提高。目前，有關(guān)pdc-進(jìn)化突變株耐受葡萄糖機(jī)制的解釋主要有以下兩種：(1)胞質(zhì)乙酰-CoA替代路徑的激活。VAN MARIS 等[25]研究發(fā)現(xiàn),蘇氨酸醛縮酶(該酶可以將蘇氨酸裂解為甘氨酸和乙醛)的胞質(zhì)錨定位點(diǎn)，并試圖引入一條胞質(zhì)乙酰-CoA合成替代路徑；通過過表達(dá)蘇氨酸醛縮酶編碼基因gly1，pdc-菌株在碳源限制的條件下可利用葡萄糖作為唯一碳源進(jìn)行生長，表明該酶催化形成的乙醛可作為胞質(zhì)乙酰-CoA合成的前體，該研究結(jié)果較好地論證了這一假設(shè)，但仍無法解釋gly1過表達(dá)的pdc-菌株在批次培養(yǎng)中對高濃度葡萄糖敏感的現(xiàn)象；(2)葡萄糖攝取過程的調(diào)控。OUD等[26]對1株不依賴C2化合物的S.cerevisiaeTAM進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時發(fā)現(xiàn)一個葡萄糖攝取負(fù)調(diào)控因子(mth1)內(nèi)部堿基發(fā)生了突變，并通過后續(xù)試驗推測MTH1降解減少導(dǎo)致的葡萄糖攝取下調(diào)或許是pdc-菌株耐受高濃度葡萄糖的原因。

2.4 2 L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗

通過葡萄糖適應(yīng)性定向進(jìn)化策略篩選得到突變菌株XY-156A之后，進(jìn)一步利用2L發(fā)酵罐對其積累丙酮酸能力進(jìn)行放大試驗。發(fā)酵初始糖質(zhì)量濃度為98 g/L，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降至約10 g/L時，補(bǔ)加800 g/L葡萄糖母液使糖質(zhì)量濃度恢復(fù)至80～90 g/L，整個發(fā)酵過程共補(bǔ)料2次。定期取樣檢測發(fā)酵過程中丙酮酸、殘?zhí)菨舛纫约吧锪康淖兓闆r，取3次試驗的平均值，結(jié)果如圖5所示。

圖5 S.cerevisiae XY-156A利用葡萄糖批次補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸過程曲線Fig.5 Fed-batch fermentation profile of pyruvic acid production from Glucose by S.cerevisiae XY-156A

在0～30 h，隨著糖的不斷消耗，菌體生物量、丙酮酸濃度不斷增長；在30～52 h，期間共進(jìn)行2次補(bǔ)料，丙酮酸濃度繼續(xù)攀升，菌體生物量在52 h時達(dá)到最大(OD600=35.56)；52 h后，糖耗速率放緩，菌體生物量也隨之緩慢下降，丙酮酸濃度繼續(xù)緩慢增加。發(fā)酵76 h后，丙酮酸濃度達(dá)到105 g/L，得率為0.5 g/g葡萄糖，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.38 g/(L·h)。與搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)相比，發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)階段的菌體生長速率、生物量、糖耗速率以及丙酮酸終濃度均有大幅度提升。這可能是由于發(fā)酵罐體系的溶氧比搖瓶體系更為充足， 因而更有利于pdc-突變菌株通過線粒體呼吸鏈將糖酵解過程產(chǎn)生的NADH快速氧化生成NAD+[27]，以維持胞內(nèi)的氧化還原平衡，而NADH的減少則可促使更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸。此外，發(fā)酵罐的傳質(zhì)傳熱效果更好，菌體與物料接觸更充分，從而更有利于菌體生長和產(chǎn)物合成。

3 討論

近年來，國內(nèi)外針對改造S.cerevisiae生產(chǎn)丙酮酸開展了大量的研究工作，并且取得了不錯的進(jìn)展。例如，WANG等[28]以單倍體菌株Y2為出發(fā)菌株，通過同源重組技術(shù)敲除PDC的編碼基因pdc1和pdc5使PDC酶活下降了98%，但獲得的突變株Y2-15需要添加醋酸鈉或者其他C2化合物才能正常生長，搖瓶發(fā)酵96 h獲得24.85 g/L丙酮酸，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.26 g/(L·h)，丙酮酸得率為0.37 g/g葡萄糖。VAN MARIS等[14]通過敲除PDC的編碼基因pdc1、pdc5和pdc6，獲得的突變株RWB837同樣無法在以葡萄糖為唯一碳源的合成培養(yǎng)基上生長，隨后對該菌株進(jìn)行葡萄糖適應(yīng)性進(jìn)化篩選，最終獲得1株能利用葡萄糖積累丙酮酸的進(jìn)化突變株TAM，分批補(bǔ)料發(fā)酵100 h獲得135 g/L丙酮酸(目前報道的最高產(chǎn)量)，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.35 g/(L·h)，丙酮酸得率為0.54 g/g葡萄糖。WANG等[24]也采用類似進(jìn)化策略對1株P(guān)DC突變株BY5419進(jìn)行馴化，最終篩選到了1株產(chǎn)丙酮酸的菌株BY5419-A0，通過搖瓶發(fā)酵120 h獲得66.4 g/L丙酮酸，生產(chǎn)強(qiáng)度為 0.55 g/(L·h)，丙酮酸得率為0.55 g/g葡萄糖。上述研究均使用單倍體營養(yǎng)缺陷型S.cerevisiae作為出發(fā)菌株，使其不能直接利用簡單培養(yǎng)基，需要添加氨基酸或維生素等，增加了發(fā)酵過程的控制難度和發(fā)酵成本，不利于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。本研究以二倍體工業(yè)釀酒酵母XY-49為出發(fā)菌株，通過失活PDC結(jié)合適應(yīng)性定向進(jìn)化的策略，最終篩選到葡萄糖耐受度高、菌體生長速度快、丙酮酸高效積累的進(jìn)化突變株XY-156A。通過分批補(bǔ)料發(fā)酵76 h，丙酮酸濃度可達(dá)105 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.38 g/(L·h)，丙酮酸得率為0.5 g/g葡萄糖，試驗結(jié)果顯示該菌株在丙酮酸工業(yè)生產(chǎn)中具備一定的應(yīng)用潛力。但其所獲得的丙酮酸得率(0.5 g/g葡萄糖)仍然較低，因此，有必要進(jìn)一步改造XY-156A以提高其丙酮酸生產(chǎn)指標(biāo)。首先，繼續(xù)敲除其余丙酮酸降解途徑的相關(guān)基因。除了PDC以外，仍然存在一些可降解丙酮酸的酶，例如，丙酮酸脫氫酶(pyrucate dehydrogenase,PDH)和丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PYC)，敲除這些酶的編碼基因可進(jìn)一步減少丙酮酸代謝[27]。其次引入輔酶再生系統(tǒng)。PDC缺失后，糖酵解過程產(chǎn)生的大量NADH無法快速轉(zhuǎn)化為NAD+，細(xì)胞的氧化還原平衡被破壞，而引入輔酶系統(tǒng)促進(jìn)NAD+再生，可將更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，從而提高丙酮酸得率[24]。最后，對發(fā)酵條件進(jìn)行綜合優(yōu)化，為S.cerevisiae工業(yè)化生產(chǎn)丙酮酸奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)。