王歡，譙順彬，田輝，石瑞麗，彭小東

1(貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽，550008)2(貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州 貴陽，550016)

花青素是一種水溶性色素，屬黃酮類化合物，其基本結(jié)構(gòu)母核是2-苯基苯并吡喃，是構(gòu)成花瓣和果實顏色的主要色素之一。有實驗證明，花青素是目前清除人體自由基最有效的天然抗氧化劑，是VC的20倍，VE的50倍，能防治多種疾病，改善人體微循環(huán)[1]。藍(lán)莓(Vaccinium spp.)，別名越橘、藍(lán)漿果，為杜鵑花科越橘屬多年生落葉或是常綠灌木。藍(lán)莓果實柔軟多汁，營養(yǎng)豐富，富含花青素、槲皮素等多種黃酮類化合物及其他類生理活性成分。研究表明，藍(lán)莓果實有很強(qiáng)的抗氧化活性，具有提高人體免疫力、防止腦神經(jīng)老化、改善視力、降低血糖血脂、預(yù)防癌癥等多種生理功能[2-3]。

藍(lán)莓酒是以藍(lán)莓果實為主要原料，經(jīng)過加工釀制以后得到的果酒，因其獨特的口感和豐富的營養(yǎng)而受到消費者的歡迎。但是目前針對藍(lán)莓酒中花青素的檢測報道較少，而且考察的花青素種類也不全[4]，因此建立一種快速、有效的藍(lán)莓酒中多種花青素的檢測方法具有重要的意義。目前，常用的花青素檢測方法有可見光分光光度法[5-7]、高效液相色譜法[8-10]及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-12]等。其中，可見光分光光度法一般測定的是樣品中花青素總的含量，不能確定單一組分含量，且易受干擾，結(jié)果準(zhǔn)確度較低；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測靈敏度高，但設(shè)備昂貴，且由于花青素在低pH值下穩(wěn)定，而低pH值對電噴霧質(zhì)譜的離子化會有一定的抑制作用，影響質(zhì)譜分析[13]。綜上，本文采用高效液相色譜法來建立同時測定藍(lán)莓酒中6種花青素的檢測方法，并對前處理步驟和檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，為開展藍(lán)莓酒的功能性研究提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試樣，自制藍(lán)莓酒。

花青素標(biāo)準(zhǔn)品(飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素)，ChromaDex公司；乙腈(色譜純)，德國默克公司；H3PO4、HCl、無水乙醇(均為分析純)，國藥集團(tuán)公司；實驗用水為經(jīng)超純水儀處理的一級水。

Aglient 1260 Ⅱ高效液相色譜儀(配DAD檢測器)，美國安捷倫公司；混勻振蕩器，Heidolph公司；SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；干燥箱，德國BINDER；電子天平(精度0.000 1 g)，瑞士Mettler Toledo公司；移液器，德國普蘭德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件

Poroshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm×2.7 μm)，美國安捷倫公司；流動相A，0.1%的H3PO4溶液；流動相B，乙腈；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫40 ℃；紫外檢測器檢測波長525 nm；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取6種花青素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.0 mg(精確至0.1 mg)于50 mL容量瓶中，10%的鹽酸甲醇溶液溶解并定容，得100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃下避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合中間液：準(zhǔn)確吸取1 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲備液至10 mL的容量瓶中，10%HCl定容至刻度，制得10.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 樣品前處理

提?。簻?zhǔn)確稱取1.00～5.00 g的藍(lán)莓酒樣品于25 mL的容量瓶中，用提取試劑V(乙醇)∶V(H2O)∶V(HCl)=2∶1∶1定容至刻度，超聲振蕩提取30 min。

水解：超聲提取后，密封好瓶塞，于120 ℃下水解1 h，取出冷卻至室溫，提取液再次定容，過0.45 μm的水系膜，待上機(jī)。

1.2.4 計算公式

花青素含量的計算，如公式(1)所示：

(1)

式中：Xi為樣品中各花青素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；Ci為標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的樣品各花青素的質(zhì)量濃度，mg/L；C0為空白的花青素的濃度，mg/L；V為定容體積，mL；m為取樣質(zhì)量，g；d為稀釋倍數(shù)?；ㄇ嗨乜偭繛楦鱾€花青素測定值之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

參考文獻(xiàn)[13]，花青素需在較低pH下進(jìn)行分離測定，且6種花青素的結(jié)構(gòu)相近，一般短的C18柱達(dá)不到分離效果，而長柱雖能達(dá)到分離效果但會占用較長的分析時間，因此選擇能夠耐低pH且分離度較高的Agilent Poroshell 120 EC-C18柱，結(jié)合花青素各組分的分離度及樣品分析時間考慮，經(jīng)過反復(fù)調(diào)節(jié)流動相比例及梯度，最后得到最優(yōu)的梯度洗脫程序如表1所示。

由圖1和圖2可知，6種花青素的出峰時間在10 min以內(nèi)，分析時間短，且樣品跟標(biāo)液均能達(dá)到很好的分離度。由圖2可知，藍(lán)莓酒中檢出了5種花青素，其中天竺葵色素未檢出，這與胡莉等研究的藍(lán)莓中未檢出天竺葵色素的情況相符[13]。

2.2 檢測波長的選擇

在確定最佳色譜條件后，本試驗采用DAD檢測器對6種花青素進(jìn)行全波長掃描(190～600 nm)。由圖3可知，除天竺葵色素的最大吸收波長為512 nm，其余5種花青素的最大吸收波長在525 nm左右，因此綜合考慮檢測靈敏度及效率值(無需切換波長)，統(tǒng)一檢測波長為525 nm。

1-飛燕草色素;2-矢車菊色素;3-矮牽牛色素;4-天竺葵色素;5-芍藥素;6-錦葵色素圖1 六種花青素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.1 The chromatogram of anthocyanins

a-飛燕單色素；b-矢車菊色素；c-矮牽牛色素；d-天竺葵色素；e-芍藥素；f-錦葵色素圖3 六種花青素的全波長掃描圖Fig.3 Full-wavelength scanning of 6 kind of anthocyanins

2.3 方法的線性及檢出限

將1.2.2的標(biāo)準(zhǔn)混合中間液進(jìn)行梯度稀釋，配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。結(jié)果表明，6種花青素在質(zhì)量濃度為0.5～10 mg/L線性良好(r>0.999 9)。采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比(S/N)的3倍確定檢出限，得到6種花青素的檢出限結(jié)果如表2所示。

2.4 藍(lán)莓酒樣品中花青素的測定及方法的回收率、精密度、穩(wěn)定性

藍(lán)莓酒樣品中花青素的測定方法為準(zhǔn)確稱取1.00 g 藍(lán)莓酒樣品，3個平行，按照1.2.3的方法進(jìn)行前處理，上機(jī)分析，結(jié)果如表3所示。

表2 花青素的線性方程及檢出限Table 2 Linear equations and LOD of anthocyanins

表3 藍(lán)莓酒中花青素的質(zhì)量濃度Table 3 The quality concentration of anthocyanins in blueberry wine

注：-代表未檢出

結(jié)果表明，藍(lán)莓酒中檢出5種花青素，未檢出天竺葵色素。5種花青素的含量從高到低分別為錦葵色素 29.49 mg/kg；矢車菊色素 17.02 mg/kg；飛燕草色素 11.32 mg/kg；矮牽牛色素 6.71 mg/kg；芍藥素 4.17 mg/kg，RSD在0.65%～5.89%(表3)。

對藍(lán)莓酒中花青素進(jìn)行測定后，準(zhǔn)確稱取1.00g藍(lán)莓酒樣品，分別加入5、10和20 mg/kg花青素混合標(biāo)液，每個濃度3個平行，按照1.2.3的方法進(jìn)行前處理，上機(jī)分析，結(jié)果如表4所示，6種花青素的回收率為80.50%～108.80%，RSD在0.54%～5.63%。

表4 藍(lán)莓酒中6種花青素的回收率Table 4 Recovery of anthocyanins in blueberry wine

精密度和穩(wěn)定性測定方法為：將6種花青素的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 mg/L)，分別于0、2、4、8、12、24 h 各進(jìn)樣 1 次，記錄其峰面積和保留時間，計算 RSD、疊加色譜信號，結(jié)果如表5和圖4所示。

表5 六種花青素的精密度和穩(wěn)定性Table 5 The precision and stability of anthocyanins

圖4 花青素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液疊加色譜圖Fig.4 The overlapped chromatograms of anthocyanins mixed standard solution

由表5和圖4可知各組分的峰面積在24 h內(nèi)無明顯變化，RSD<3.00%；保留時間穩(wěn)定，結(jié)果表明方法的精密度和穩(wěn)定性良好。

2.5 水解溫度選擇

花青素主要以花色苷的形式存在，試樣通過水解后生成花青素，因此水解溫度直接影響花青素的形成。為有更多的溫度選擇，得到更好的水解效果，本試驗選擇在烘箱中進(jìn)行加熱水解反應(yīng)，溫度在70、80、90、100、110、120、130 ℃，水解1 h，考察溫度對各花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

如圖5所示,當(dāng)溫度在120 ℃時，各花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，120 ℃以上時略有下降，且溫度越高，花青素降解的速度越快，前處理對密封的要求也越高，且易發(fā)生噴濺，綜合考慮，選擇120 ℃作為最佳水解溫度。

圖5 水解溫度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature

2.6 水解時間選擇

水解時間的長短也直接影響花青素質(zhì)量濃度的高低。實驗選擇在120 ℃水解20、30、45、60、90、120 min，考察水解時間對花青素質(zhì)量濃度的影響。如圖6所示,60～90 min，各花青素質(zhì)量濃度達(dá)到最高，90 min后開始下降，結(jié)合時效考慮，選擇60 min的水解時長為最佳。

圖6 水解時間的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time

3 結(jié)論

本文研究建立了藍(lán)莓酒中的6種花青素的高效液相色譜檢測方法，檢出藍(lán)莓酒中含有飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、錦葵色素5種花青素，其中錦葵色素含量最高(29.49 mg/kg)，矢車菊色素(17.02 mg/kg)、飛燕草色素(11.32 mg/kg)次之。實驗采用烘箱加熱水解的方式，在溫度為120 ℃，水解時間為60 min時，花青素的提取效果最佳，優(yōu)化了提取和色譜條件，方法的線性良好，檢出限較低，精密度和穩(wěn)定性良好，回收率在80.50%～108.80%，可作為藍(lán)莓酒中花青素快速檢測的參考方法。