都蕓，王開宇，左惠君，邱怡筠，張露月

(煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺，264000)

氰化物是一種劇毒物質(zhì)，在所有的氰化物中，氰化氫的毒性最大，CN-能夠抑制細(xì)胞色素C氧化酶的活性，阻斷呼吸鏈?zhǔn)菇M織缺氧，進(jìn)而產(chǎn)生乳酸等大量酸性物質(zhì)，最終導(dǎo)致代謝性酸中毒從而引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[1]。白酒中氰化物的主要來源與其制作原料有關(guān)，如木薯、豆類、高粱等食物中都有氰苷的存在。食用植物中的氰化物多以氰苷配糖體形式存在，其種類有苦杏仁氰苷、亞麻氰苷、棉豆氰苷等[2]，氰苷在發(fā)酵過程中水解產(chǎn)生HCN。因此，氰化物是酒類的一項重要監(jiān)測指標(biāo)，其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性對白酒質(zhì)量安全有重要意義。

目前，白酒中氰化物的檢測方法有化學(xué)分析法、分光光度法、色譜法、原子吸收法[3]。而GB 5009.36—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氰化物的測定中規(guī)定了2種定量方法(分光光度法、氣相色譜法)和1種定性方法，本文根據(jù)白酒氰化物的判定標(biāo)準(zhǔn)GB 2757—2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 蒸餾酒及其配制酒對GB 5009.36—2016第一法分光光度法測量白酒中氰化物方法進(jìn)行了系統(tǒng)、完整的不確定度評定，分析整個實驗過程中的不確定度來源，并分別進(jìn)行計算，通過各個分量在整體不確定度中的占比，分析其對最終檢測結(jié)果的影響，為調(diào)整實驗過程進(jìn)行指導(dǎo)，有效減少實驗結(jié)果的誤差，確保測量結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 方法依據(jù)

測量依據(jù)GB 5009.36—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氰化物的測定中第一法分光光度法[4]，在堿性條件下加熱除去高沸點有機物，然后在pH=7.0條件下，CN-與氯胺-T反應(yīng)生成CICN，CICN再與異煙酸作用，水解后生成戊烯二醛，最后與吡唑酮縮合成藍(lán)色染料[5]，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。該標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定測定時樣品的溫度，參照GB 5009.225—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測定[6]中的要求，統(tǒng)一規(guī)定為在20 ℃下樣品中氰化物的含量。

1.2 試劑與儀器

白酒樣品使用45%vol優(yōu)級濃香型白酒；實驗室環(huán)境溫度(20±2) ℃。水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GBW(E)080115)，ρ(CN-)=50.0 μg/mL，相對擴展不確定度Ur=1%。

Cary 60 UV—Vis紫外可見分光光度計，安捷倫科技有限公司；SCG-4恒溫水浴鍋(精密度0.1 ℃)，寧波新型生物。具塞比色管(10 mL)；單標(biāo)吸量管(2 mL)；流出式分度吸量管(1、2 mL)；容量瓶(100 mL)(A級)。

1.3 測定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)使用溶液配制

取2 mL水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用2 g/L NaOH溶液定容至100 mL容量瓶中，標(biāo)準(zhǔn)使用溶液質(zhì)量濃度為1.00 μg /mL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制

用分度吸量管分別吸取1.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL具塞比色管中，加2 g/L NaOH至5 mL。

1.3.3 樣品處理

吸取1.0 mL試樣于50 mL燒杯中，加入5 mL 2 g/L NaOH溶液，混勻后放置10 min，然后放于120 ℃電加熱板上加熱至溶液剩余約1 mL，取下放至室溫，用2 g/L NaOH溶液轉(zhuǎn)移至10 mL具塞比色管中，最后加2 g/L NaOH至5 mL。

1.3.4 顯色測定過程

于試樣及標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入2滴酚酞指示劑，加入體積分?jǐn)?shù)為4%的乙酸溶液調(diào)至紅色褪去，再用2 g/L NaOH溶液調(diào)至近紅色，然后加2 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.5 mol/L，pH=7.0)，放入25～30 ℃水浴中10 min，再加入0.2 mL氯胺-T溶液(10 g/L)，搖勻放置3 min，加入2 mL異煙酸-吡唑啉酮溶液(異煙酸溶液Ⅰ：稱取1.5 g異煙酸溶于24 mL 20 g/L NaOH溶液中，加水至100 mL；吡唑啉酮溶液Ⅱ：稱取0.25 g吡唑啉酮，溶于20 mL無水乙醇中。使用時將溶液Ⅰ、Ⅱ按體積比5 ∶1混合[7])，加水稀釋至刻度，加塞振蕩混合均勻，在37 ℃恒溫水浴鍋中放置40 min，取出冷卻至室溫。用1 cm 比色皿以空白管調(diào)節(jié)零點，于638 nm處測量吸光度。標(biāo)準(zhǔn)系列各點及樣品溶液分別測量3次。

1.4 樣品測量數(shù)據(jù)及計算結(jié)果

樣品測量數(shù)據(jù)及測量結(jié)果如表1所示。

表1 樣品測量數(shù)據(jù)及測量結(jié)果Table 1 Sample measurement data and measurement results

2 數(shù)學(xué)模型建立及測量不確定度來源分析

2.1 白酒氰化物計算

根據(jù)白酒氰化物的判定標(biāo)準(zhǔn)GB 2757—2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 蒸餾酒及其配制酒中氰化物(以HCN計)質(zhì)量濃度≤8.0 mg/L，且按酒精度100%vol折算[8]，將GB 5009.36—2016中計算修改為公式(1)：

(1)

式中：X，白酒樣品中氰化物質(zhì)量濃度(以HCN計)(按酒精度100%vol折算)，mg/L；c，樣品溶液中氰根的質(zhì)量，μg；V，樣品體積，mL；27.0，HCN摩爾質(zhì)量的數(shù)值，g/mol；26.0，CN-摩爾質(zhì)量的數(shù)值，g/mol；100，換算為酒精度100%vol，%vol；E，白酒樣品實際酒精度，%vol；R，回收率，%。

2.2 測量不確定度來源分析

分光光度計檢測溶液的吸光度與溶液中目標(biāo)物的濃度成正比，因此顯色液的定容體積也是測量不確定度的一個分量，將其合并至標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和樣品溶液質(zhì)量含量的不確定度評定中，標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液濃度不確定度模型如公式(2)、公式(3)所示：

c標(biāo)=f(c1，V3，V4)

(2)

c=f′(c標(biāo)，c擬，V2)

(3)

式中：c1， 氰標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度；V3，吸取氰標(biāo)準(zhǔn)使用液的體積；V4，標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的定容體積；c擬，標(biāo)準(zhǔn)溶液系列曲線擬合；V2，樣品溶液顯色定容體積。

因此樣品不確定度的測量模型如公式(4)所示：

X=F(c，V1，MHCN，MCN-，E，R)

(4)

式中：c，樣品溶液中氰化物的質(zhì)量，μg；V1，樣品取樣體積，mL；MHCN，HCN摩爾質(zhì)量的數(shù)值，g/mol；MCN-，CN-摩爾質(zhì)量的數(shù)值，g/mol；E，白酒樣品實際酒精度，45.2 %vol；R，回收率，%。

根據(jù)測量模型，將模型中樣品溶液中氰化物質(zhì)量的不確定度分量按照J(rèn)JF1059.1—2012 測量不確定度評定與表示[9]要求展開，分光光度法測量白酒中氰化物含量的不確定度因果分析如圖1所示。

圖1 氰化物測定不確定度來源Fig.1 A graphical representation of the source of uncertainty in cyanide determination

3 測量不確定度評定

3.1 評定A類不確定度

A類不確定度就是測量重復(fù)性的不確定度，等于測量結(jié)果平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差[10]。6次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測量平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對不確定度為：

3.2 評定樣品吸取體積的不確定度u(V1)

3.2.1 單標(biāo)吸量管容量引入的不確定度u1(V1)

3.2.2 溫度波動對單標(biāo)吸量管引入的不確定度u2(V1)

45%vol白酒的體積膨脹系數(shù)根據(jù)《新編酒精密度濃度和溫度常數(shù)數(shù)據(jù)表》[12]中表Ⅱ“酒精溶液密度與溫度和體積濃度關(guān)系表”， 45%vol酒精在20 ℃附近的密度如表2所示。

表2 45%vol酒精在不同溫度下的密度Table 2 Density of 45%vol alcohol at different temperatures

3.2.3 取樣體積不確定度u(V1)的合成

容量允差和溫度對取樣體積產(chǎn)生的不確定度是互相獨立的，根據(jù)公式合成得到取樣體積的不確定度和相對不確定度為：

3.3 樣品溶液顯色定容體積的不確定度u(V2)

3.3.1 比色管容量允差引入的不確定度u1(V2)

3.3.2 溫度波動引入的不確定度

u(V2)=u1(V2)=0.057 7 mL

3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制引入的不確定度u(c標(biāo))

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)使用溶液配制引入的不確定度u(c1)

3.4.1.1 水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(儲備液)引入的不確定度u1(c1)

查證書得相對擴展不確定度為1%(k=2),相對不確定度為：

3.4.1.2 吸取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(儲備液)引入的不確定度u2(c1)

比如說“東漢青釉雙系瓷壺”，只翻譯成了Double-lug Celadon Kettle，“東漢”卻沒有翻譯。關(guān)于文物的出土地大多沒有翻譯。出土地應(yīng)該屬于提示性公示語，對于對象起到提示或者告知作用，應(yīng)當(dāng)翻譯，卻沒有翻譯。

3.4.1.3 定容體積引入的不確定度u3(c1)

3.4.1.4 標(biāo)準(zhǔn)使用溶液配制相對不確定度的合成

標(biāo)準(zhǔn)使用溶液配制相對不確定度為：

3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制引入的不確定度u(V標(biāo))

標(biāo)準(zhǔn)系列各個點的配制過程引入的不確定度主要由分度吸量管容量允差、比色管定容和溫度組成，而溫度在較短時間內(nèi)變化較小，故忽略溫度對其的影響。

表3 各濃度的不確定度及其分量計算結(jié)果Table 3 Uncertainty of each concentration and calculation results of its components

3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制不確定度的合成

按每個濃度相對不確定度算術(shù)平方和開方得到[15]不確定度為:

ur(c)=

3.5 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度u(c擬)

標(biāo)準(zhǔn)溶液系列共6個濃度，每個濃度測量3次，得到線性方程為A=0.366 8m+0.003 65，R2=0.999 8，在測量范圍內(nèi)，吸光度值對CN-線性關(guān)系良好；每份樣品溶液測量3次，以吸光度平均值計算溶液中氰根質(zhì)量。由表1可知樣品溶液氰根的平均質(zhì)量為0.953 μg。標(biāo)準(zhǔn)溶液系列具體測量結(jié)果如表4所示。

表4 標(biāo)準(zhǔn)系列各點吸光度的測量值Table 4 measurement values of absorbance at each point in the standard series

樣品溶液由擬合曲線引入的不確定度[16]為:

標(biāo)準(zhǔn)曲線峰面積比的殘差計算為:

式中:Ai為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度；M為標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線點數(shù)，M=6；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液每點測量次數(shù)，n=3。

擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對不確定度為：

3.6 白酒酒精度不確定度的評定u(E)

酒中酒精度測定的不確定度的來源主要有酒精度的測量重復(fù)性、容量瓶取樣和蒸餾后的定容體積、蒸餾液20 ℃下密度的測定、酒精度測量結(jié)果的修約，具體評定過程見《密度瓶法測量白酒中酒精度的不確定度評定》[17]，評定結(jié)果為酒精度45.2%vol，擴展不確定度u(E) =0.1%vol，相對不確定度為:

3.7 評定摩爾質(zhì)量比值的不確定度u(M比)

表5 國際原子量數(shù)值及其標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 5 international atomic weight values and their standard uncertainties

M(H+)、M(CN-)的不確定度由原子量和數(shù)據(jù)修約2部分組成， H+、CN-修約為3位有效數(shù)字，其中M(CN-)的不確定度由C和N兩部分組成，不確定度計算結(jié)果如表6所示:

表6 M(H+)、M(CN-)不確定度計算結(jié)果Table 6 uncertainty calculation results of M(H+)、M(CN-)

不確定度和相對不確定度為：

0.001 11

3.8 加標(biāo)回收率R的不確定度評定

加標(biāo)試驗的具體過程：吸取水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液1.00 mL于100 mL容量瓶中，并用體積分?jǐn)?shù)為45%的乙醇溶液定容，搖勻，即加標(biāo)物質(zhì)溶液濃度為0.5 μg/mL，后續(xù)測定過程同1.3，分別進(jìn)行6次加標(biāo)回收實驗，測定結(jié)果如表7所示。

表7 回收率試驗結(jié)果Table 7 Results of recovery rate test

3.8.1 平均回收率測量重復(fù)性引入的不確定度u(xs)

3.8.2 加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度u(xs)

加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度有水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(儲備液)、吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液、定容體積，具體評定過程參考3.4.1。

水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(儲備液)、吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液定容體積相對不確定度分別為：

加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度合成為：

3.8.4 回收率R顯著性檢驗

3.9 評定標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度

根據(jù)評定過程可知，氰化物測量重復(fù)性、樣品的取樣體積、樣品的定容體積、標(biāo)準(zhǔn)溶液系列、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、酒精度折算及摩爾質(zhì)量這7部分互相獨立，因此合成相對不確定為：

=0.013 7

4 擴展不確定度及不確定度報告

取包含因子k=2，U=k×ur×X=2×0.013 7×2.19=0.06 mg/L,白酒中氰化物報告：X=(2.19±0.06)mg/L，k=2，各類相對不確定度主要分量及貢獻(xiàn)如表8及圖2所示。

5 結(jié)論

通過對白酒氰化物分光光度檢測方法不確定度的評定，當(dāng)測量結(jié)果為2.19 mg/L時，擴展不確定度為0.06 mg/L，通過此次評定,可以得出標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制引入的不確定度分量是該測量結(jié)果不確定度中占比最大的，因此在實驗過程中，對于標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制時要嚴(yán)格按照實驗要求規(guī)范操作，降低其引入的不確定度,確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖2 各類不確定度主要分量占比Fig.2 Schematic diagram of the proportion of major components of various uncertainties

表8 各類相對不確定度主要分量及貢獻(xiàn)Table 8 Major components and contributions of various relative uncertainties

注：-代表無