梁冬松，王芳，韋炎冶，黎小梅，陸穎，唐燦美，楊立芳*

1(桂林理工大學(xué)南寧分校，廣西 南寧，532100) 2(廣西民族大學(xué) 海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點實驗室，廣西 南寧，530006) 3(廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室,廣西 南寧，530008)

茶葉微生物發(fā)酵是以茶葉為基質(zhì)，接種特定微生物進行共培養(yǎng)，通過它們的代謝等作用使茶葉發(fā)生生理生化變化。經(jīng)過微生物發(fā)酵后的茶葉增加了許多微生物代謝活性物質(zhì)，使有效成分種類增加，品質(zhì)得到很大的改善。因此，近年來“茶+食用菌”的探索一直受研究者的青睞[1]。茶葉中富含茶多酚、咖啡堿、兒茶素等多種活性物質(zhì)[2-3]，在藥理上具有降血壓、降血糖、預(yù)防動脈粥樣硬化、抗菌消炎、利尿止痢等作用，同時其還具有抗氧化、抗衰老、助消化、緩解疲勞等保健功效[4-7]。白參菌是一種食藥兼用的珍稀菇菌，其多糖具有抗癌作用，可治療小兒腹瀉、頭暈、偏頭痛等疾病，在白參菌的發(fā)酵液中含有豐富的鷹眼物質(zhì)，具體包括氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、單糖、多糖、有機酸、酚類化合物和油脂等多種活性化學(xué)成分。以茶為基質(zhì)，接種白參菌進行固體發(fā)酵[8-9]，加工具有茶和白參菌雙重功效的新型功能菌茶，可提高茶葉中活性成分的含量，產(chǎn)生對人體健康更有益的次生代謝產(chǎn)物，并可提升茶葉的綜合利用率。因此，對于白參菌發(fā)酵茶的研究具有十分重要的意義。

茶葉經(jīng)過發(fā)酵后其活性物質(zhì)種類和含量會在一定程度上發(fā)生變化[10-11]。目前茶葉中活性成分的檢測通常包括化學(xué)分析方法[12]、高效液相色譜法[13-16]、氣相色譜法[17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[18-19]、紅外光譜法[20]、紫外可見光譜法[21-22]等。但化學(xué)分析方法準(zhǔn)確度不夠高，光學(xué)分析法很難得到茶中茶多酚類單體活性成分的含量，電化學(xué)分析方法同樣只能確定茶多酚的總量，而高效液相色譜分析法可同時測定出復(fù)雜樣品中多種成分的含量，具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點。本研究通過建立高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)檢測方法，同時對茶葉發(fā)酵前后6種活性成分進行比較研究，為進一步探討功能菌茶的品質(zhì)研究提供重要依據(jù)，為茶產(chǎn)業(yè)的深加工提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咖啡堿(純度≥ 98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；可可堿(純度100%)，上海源葉生物科技有限公司；表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯(純度≥ 98%)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；表沒食子兒茶素沒食子酸酯(純度≥ 98%)，上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher Scientific；85%H3PO4，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀(配有DAD 檢測器)，美國Agilent公司；RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海人和科學(xué)儀器有限公司；ZHJH-1109B超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；HPS-160生化培養(yǎng)箱，哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠；DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精密實驗設(shè)備有限公司；G154D高壓滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；BS110S電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HPLC 條件

色譜柱，wondaSil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈(A)和0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(見表1)，流速，1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量，20 μL，檢測波長 280 nm。

表1 梯度洗脫流動相比例 單位：%Table 1 The gradient elution program

1.3.2 白參菌種的活化

將經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的馬鈴薯PDA 培養(yǎng)基于超凈工作臺中倒入平板中，挑取白參菌絲接種在凝固的PDA培養(yǎng)基平板上，置于31 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等菌絲體長滿平板時，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。挑取活化的菌絲逐步接種于葡萄糖含量不斷降低的茶葉水培養(yǎng)基上，至菌絲接種在無糖茶水培養(yǎng)基上能夠快速生長，鋪滿平板，再以茶葉作為培養(yǎng)基質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)菌種，逐步降低培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，直至菌種可在無糖茶葉培養(yǎng)基上能夠快速生長，將馴化好的菌種保存于4 ℃。

1.3.3 白參菌發(fā)酵茶的制備

取馴化好的白參菌菌種接種于濕度為75%的40 g綠茶培養(yǎng)基中，封口后充分搖晃置于室溫下培養(yǎng)。待菌絲長滿平板時，持續(xù)培養(yǎng)4～6 d。然后，將培養(yǎng)基里長滿菌絲后的發(fā)酵茶葉置于烘箱中，在65 ℃下烘干至恒重，密封干燥，得白參菌發(fā)酵茶。

1.3.4 樣品前處理

綠茶處理：稱量10.0 g綠茶，加100 mL蒸餾水浸提1 h，過濾浸提液，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，用蒸餾水溶解浸膏轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容，得綠茶提取液。移取綠茶提取液1 mL于25 mL容量瓶定容，得待測綠茶提取液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌茶處理：菌茶的處理與上述綠茶處理方式一致。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取可可堿10.0 mg、表沒食子兒茶素5.0 mg、咖啡堿50.0 mg、表兒茶素5.0 mg、表沒食子兒茶素沒食子酸酯5.0 mg、表兒茶素沒食子酸酯10.0 mg于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液。逐級稀釋，用甲醇定容，得混合標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為可可堿(12.5～400 μg/mL)，表沒食子兒茶素(6.25～200 μg/mL)，咖啡堿(62.5～2 000 μg/μL)，表兒茶素(6.25～200 μg/mL)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(6.25～200 μg/mL)，表兒茶素沒食子酸酯(12.5～400 μg/mL)。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)混合樣品色譜圖

圖1為6種混合標(biāo)準(zhǔn)品樣品色譜圖，標(biāo)準(zhǔn)品可可堿、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯； 6種成分的出峰時間為10.62、16.14、17.61、22.16、24.33、32.28 min。由圖1可知，各標(biāo)準(zhǔn)品在35 min內(nèi)均完全分離，各成分分離度高、峰型好。表明該方法適合于同時對茶葉中可可堿、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯的分離檢測。

1-可可堿;2-表沒食子兒茶素;3-咖啡堿;4-表兒茶素;5-表沒食子兒茶素沒食子酸酯;6-表兒茶素沒食子酸酯圖1 六種混合對照品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 6 mixed reference substances

2.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

分別取“1.3.5”項下不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾頭過濾，按照“1.3.1”項下色譜條件注入高效液相色譜儀中，重復(fù)進樣5次，記錄色譜峰面積。以峰面積S對濃度C作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行回歸計算，具體結(jié)果見表2。測定儀器信噪比(S/N)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至信噪比3

表2 六種不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 2 The linear relativity,LOD and LOQ of six mixed standard substances with different concentrations

2.3 重復(fù)性試驗

分別吸取“1.3.4”項中綠茶和發(fā)酵菌茶提取液各5份，經(jīng)0.45 μm微孔水系濾頭過濾，按照 “1.3.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖峰面積，帶入“2.2”項下線性方程并計算。綠茶樣品中6種活性成分(可可堿、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯)的RSD依次為2.92%、5.13%、3.05%、4.03%、2.47%、4.54%。發(fā)酵菌茶樣品中6種活性成分的RSD依次為3.29%、2.61%、3.13%、5.19%、2.78%、4.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

分別吸取“1.3.4”項中同一綠茶和發(fā)酵菌茶提取液，經(jīng)0.45 μm微孔水系濾頭過濾，按照“1.3.1”項下色譜條件分別在0、 3、 6、 9、 12、 15 h進行測定，記錄色譜峰面積，計算綠茶樣品中6種活性成分(可可堿、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯)的RSD依次為0.25%、1.07%、0.04%、0.24%、1.04%、1.14%。發(fā)酵菌茶樣品中6種活性成分的RSD依次為0.46%、4.37%、0.30%、5.19%、1.75%、0.43%。結(jié)果表明,綠茶和發(fā)酵菌茶提取液在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率與精密度

分別稱取綠茶和發(fā)酵菌茶各3份，每份10.0 g，精密稱定，分別加入加標(biāo)水平為20、 40、 80 μg/g 3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.3.4項樣品前處理步驟對加標(biāo)綠茶和發(fā)酵茶樣品進行處理，得加標(biāo)綠茶和發(fā)酵菌茶提取液進行加標(biāo)回收率實驗，結(jié)果如表3和表4所示，綠茶提取液中可可堿、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯的加標(biāo)回收率均≥95.06%，6種有效成分回收率RSD均≤0.86%；發(fā)酵菌茶提取液中上述6種有效成分加標(biāo)回收率分別≥85.06%，6種有效成分回收率RSD均≤4.23%。

表3 綠茶加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=6)Table 3 Results of recovery tests of green tea

表4 白參菌茶加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=6)Table 4 Results of recovery testsof Schizophyllum communeh fermented tea

2.6 綠茶和發(fā)酵茶樣品測定

分別稱取綠茶和發(fā)酵菌茶各5份，每份10.0 g，精密稱定，按照“1.3.4”項的方法制備供試品溶液，分別吸取按照“1.3.1”項色譜條件進行測定各供試品溶液中6種有效成分含量，比較發(fā)酵前后各有效成分含量的變化，結(jié)果如圖2所示，綠茶與白參菌共發(fā)酵后，茶葉中可可堿和咖啡堿的含量幾乎沒有變化，但表沒食子兒茶素含量降低了0.46%，表兒茶素含量降低了1.82%，表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量降低了2.81%，表兒茶素沒食子酸酯含量降低了2.78%，RSD值為0.08%～3.39%。性狀上，綠茶提取液顏色較淺，而發(fā)酵后提取液顏色較深，呈棕黃色，苦澀感降低，口感更佳。

1-可可堿；2-表沒食子兒茶素；3- 咖啡堿；4-表兒茶素；5-表沒食子兒茶素沒食子酸酯；6-表兒茶素沒食子酸酯圖2 高效液相色譜圖綠茶和白參菌茶Fig.2 HPLC chromatograms of green tea and Schizophyllum communeh fermented tea

3 結(jié)論

本研究建立了同時檢測茶葉發(fā)酵前后6種活性成分含量變化的高效液相色譜方法。6種活性成分質(zhì)量濃度在6.25～2 000 μg/mL下線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2在0.995 5～0.999 9，檢出限在0.312 5～1.870 μg/mL。本方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠滿足茶葉中多種活性成分的定性、定量檢測需求。

對白參菌茶發(fā)酵前后的活性成分進行測定，結(jié)果表明，綠茶與白參菌共發(fā)酵后，茶葉中咖啡堿和可可堿含量幾乎沒有變化，表沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯的含量均大幅下降，降低比例高達80 %以上，從而改善了粗茶的活性成分，提高茶湯口感，有利于促進兼?zhèn)洳枞~和藥食用真菌雙重效用的新型保健茶品的開發(fā)。