石鏡明，段紅玉，張潔，孫正啟

(1.西藏民族大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教研室，陜西 咸陽 712082；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌二科，陜西 咸陽 712000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年性癡呆癥中最常見的形式，全世界約有4 000萬AD患者，約占老年癡呆的80%，預(yù)計(jì)到2050年，這個(gè)數(shù)量將翻三番[1-2]。β淀粉樣蛋白(amyloid-β peptide，Aβ)可溶性寡聚體是導(dǎo)致AD發(fā)病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素之一[3]，而Aβ由β-分泌酶(β-secretase)、β位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1,BACE1)和γ-分泌酶(γ-secretase)切割其前體蛋白形成[4]。其中，淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)是Ⅰ型膜蛋白，其N端位于細(xì)胞外，C端位于細(xì)胞內(nèi)[5]。APP的水解可以分為兩種途徑：①抗Aβ生成途徑，阻止Aβ產(chǎn)生，主要是α-分泌酶(α-secretase)解整合素金屬蛋白酶(a-disintegrin and metalloproteinase，ADAM)和γ-secretase的水解作用；②Aβ生成途徑，37-43肽的Aβ通過其前體蛋白水解處理產(chǎn)生，主要依賴于BACE1和γ-secretase 的水解作用[6]。盡管Aβ相關(guān)的研究已經(jīng)進(jìn)行了多年，但對(duì)于其胞內(nèi)代謝的途徑還存在一些爭議，包括Aβ的產(chǎn)生部位究竟是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)還是高爾基體，以及Aβ產(chǎn)生后從膜上脫離還是進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)涵體或是繼續(xù)循環(huán)等問題?，F(xiàn)就Aβ在胞內(nèi)的生成過程及代謝途徑予以綜述，為Aβ在AD的毒性機(jī)制研究提供一定的參考。

1 Aβ生成的亞細(xì)胞部位

在抗Aβ生成途徑中，ADAM對(duì)APP進(jìn)行水解，得到一個(gè)刪節(jié)的APPα-C端片段(C-terminal fragment,CTF)(或C83)以及sAPPα(APP被α-secretase水解后產(chǎn)生的N端片段)，隨后這個(gè)α-CTF片段被γ-secretase在膜內(nèi)酶切產(chǎn)生一個(gè)刪節(jié)的Aβ肽被稱為P3肽(Aβ17-42)[7]，見圖1(A)。在Aβ生成途徑中，BACE1的激活將引起APP膜外片段sAPPβ(APP被β-secretase水解后產(chǎn)生的N端片段)的脫落，并產(chǎn)生APP C端片段β-CTF(或C99)，β-CTF的裂解發(fā)生在生物膜的疏水環(huán)境中[8]，經(jīng)過γ-secretase裂解后，在細(xì)胞外液和腦積液中均可以發(fā)現(xiàn)Aβ[9]，見圖1(B)。然而，這些水解發(fā)生的亞細(xì)胞部位仍不完全清楚，APP的分泌途徑也存在一定的爭議。有研究認(rèn)為，β-CTF及α-CTF被γ-secretase水解的部位在ER及反面高爾基體上[10]；另有研究卻認(rèn)為，ER及反面高爾基體上并沒有活性的γ-secretase[11]。

ADAM10水解APP產(chǎn)生的片段脫落主要發(fā)生在細(xì)胞表面并不生成完整的Aβ，因此文中對(duì)不完整的Aβ不加敘述。而BACE1是Ⅰ型膜蛋白，該蛋白自產(chǎn)生后作為一個(gè)不能發(fā)揮功能的酶原形式存在，在其成熟過程中，BACE1需要經(jīng)歷大量的翻譯后共修飾，包括N-糖基化、二硫鍵的形成和棕櫚化[12]。未成熟的BACE1前肽會(huì)在成熟的過程中被弗林蛋白酶及相關(guān)蛋白酶去除[13]。BACE1會(huì)富集在細(xì)胞膜的脂筏結(jié)構(gòu)(lipid raft)中[14]，見圖2。由于BACE1與APP都富集到同一部位，很可能導(dǎo)致APP的水解。綜上所述，ADAM10主要的活性部位位于質(zhì)膜中。BACE1主要的活性部位是早期內(nèi)涵體。γ-secretase活性部位主要是循環(huán)的內(nèi)涵體、溶酶體和質(zhì)膜。

1.1BACE1在內(nèi)涵體內(nèi)產(chǎn)生活性 BACE1作為一種天冬氨酸酶，它的活性具有酸性pH最佳值(約為4.5)[15]，這與BACE1在內(nèi)涵體中產(chǎn)生活性的結(jié)論相似。通過抑制溶酶體和內(nèi)涵體中蛋白的降解，發(fā)現(xiàn)β-CTFs也聚集在內(nèi)涵體和溶酶體中[16]。人們?cè)O(shè)計(jì)出更高效的BACE1抑制劑，可以在內(nèi)涵體中抑制APP被BACE1水解，導(dǎo)致BACE1聚集在內(nèi)涵體內(nèi)；膜結(jié)合的BACE1抑制劑比非膜結(jié)合的BACE1抑制劑更有效；BACE1是目前公認(rèn)的β-secretase的專門術(shù)語[17]。BACE1是膜結(jié)合的天冬氨酸蛋白酶，其活性位點(diǎn)位于腔/胞外空間，與胃蛋白酶家族具有結(jié)構(gòu)相似性，除BACE1外，另一個(gè)同源的蛋白酶BACE2也被鑒定出來，但它的作用類似于ADAM，是一種非淀粉質(zhì)酶[17-18]。BACE1是一種完全單一的β-secretase，因?yàn)樘蕹鼴ACE1可以完全阻止Aβ的產(chǎn)生[19]。BACE1廣泛表達(dá)，其中，在腦和胰腺內(nèi)的表達(dá)量最大，其生理相關(guān)性目前還不清楚。APP在大腦中表達(dá)量很高，同時(shí)伴隨著高水平的BACE1，使大腦成為高Aβ生成的主要組織，這就能解釋為什么AD是腦部疾病。BACE1是一種重要的治療靶點(diǎn)，因?yàn)樗粌H抑制和降低Aβ水平，同時(shí)也防止包含整個(gè)Aβ的β-CTFs，而β-CTFs是形成Aβ的最終底物積累[20]。到目前為止，只有很少的生理學(xué)底物被證實(shí)與BACE1有明確的關(guān)聯(lián)。剔除BACE1的小鼠仍可以繁殖，并沒有表現(xiàn)出任何重大的行為、形態(tài)或發(fā)育缺陷[21]。

1A:抗Aβ生成途徑由α-secretase和γ-secretase的水解作用完成。α-CTF(或C83)：APP被α-secretase水解后產(chǎn)生的C端片段；sAPPα：APP被α-secretase水解后產(chǎn)生的N端片段；P3肽:Aβ17-42。1B:Aβ生成途徑由β-secretase和γ-secretase的水解作用完成。β-CTF(或C99)：APP被β-secretase水解后產(chǎn)生的C端片段；sAPPβ:APP被β-secretase水解后產(chǎn)生的N端片段。AICD：α-CTF被γ-secretase水解后產(chǎn)生的C端片段

圖1 APP的兩種水解途徑

Nucleus：細(xì)胞核；ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Golgi：高爾基體；Early endosome:初級(jí)內(nèi)體；Recycling endsome:再循環(huán)內(nèi)體；Lysosomes:溶酶體；Plasma membrane：細(xì)胞膜；γ-secretase：γ-分泌酶；ADAM10:解整合素金屬蛋白酶10；BACE1：β位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白裂解酶1

圖2 三種分泌酶在細(xì)胞內(nèi)的活性部位分析

1.2γ-secretase產(chǎn)生活性的亞細(xì)胞部位 γ-secretase在跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)水解APP得到完整的Aβ，γ-secretase的結(jié)構(gòu)和功能曾被廣泛討論[22]。γ-secretase是由四個(gè)亞基組成的蛋白酶復(fù)合體[23]，其中 Presenilin(PS)1或PS2在跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有兩個(gè)關(guān)鍵的天冬氨酸殘基，它們是γ-secretase天冬氨酸蛋白酶活性催化域的一部分[24]，另外的成分是Neistin(NCT)、APH-1A或APH-1B、PS增強(qiáng)子PEN-2，但NCT、APH-1和PEN-2的生物學(xué)功能仍不完全清楚[25]，NCT可能是一種尺寸選擇性的底物受體[26]，但這個(gè)說法遭到一定的質(zhì)疑[27]。γ-secretase的APP膜內(nèi)處理并不局限于單個(gè)位點(diǎn)，似乎γ-secretase底物在其跨膜的內(nèi)部會(huì)裂解幾次，最終的γ-裂解位點(diǎn)不精確，因?yàn)樵谏項(xiàng)l件下，其裂解產(chǎn)物是37～43個(gè)氨基酸的Aβ[28]。這種差異對(duì)于AD病理學(xué)的理解最為重要，在這些產(chǎn)物中，Aβ42更容易形成低聚物，這種低聚物將影響記憶及腦神經(jīng)細(xì)胞的存活率[29]。成熟的、具有酶活性的PS/γ-secretase沒有定位于ER、高爾基體、高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡上，而主要定位于內(nèi)涵體/溶酶體和細(xì)胞膜上，也包括吞噬體和自噬體內(nèi)[30]。γ-secretase的亞基在ER/早期無組裝或僅有部分組裝結(jié)構(gòu)，因此，早期γ-secretase沒有酶活性。支持這些數(shù)據(jù)的主要觀點(diǎn)包括：APP/C99/C83并沒有在ER上被γ-secretase處理[31]；通過免疫電鏡顯示，在高爾基體或反面高爾基體上不能觀察到PS1，而在ER及質(zhì)膜上卻可以觀察到；ER池內(nèi)的PS1并未發(fā)生組裝，而質(zhì)膜池內(nèi)的PS1已經(jīng)組裝，且具有活性[32]；只有成熟的糖基化的NCT可以在激活的γ-secretase復(fù)合體中存在，未成熟的非糖基化的NCT則不會(huì)在激活的γ-secretase復(fù)合體中存在，γ-secretase結(jié)合的NCT很可能已經(jīng)通過了高爾基體并主要分布于質(zhì)膜上[31]。綜上所述，γ-secretase具有不同的特征主要依賴于亞細(xì)胞的定位、pH及磷脂成分的改變，由此可見，γ-secretase比例的改變也是AD的病源基礎(chǔ)。綜上所述，γ-secretase對(duì)APP的裂解很可能發(fā)生在質(zhì)膜以及內(nèi)涵體/溶酶體上。

2 APP的分泌和代謝

APP在胞內(nèi)的分泌途徑如圖3所示。在APP從ER到細(xì)胞膜的過程中，糙面ER合成的APP在ER和高爾基體內(nèi)經(jīng)過N-和O-連接的糖基化修飾，并在高爾基體進(jìn)行酪氨酸磷酸化及硫酸化加工，再分泌至細(xì)胞膜；在過量表達(dá)APP的細(xì)胞內(nèi)僅有10%的APP可以到達(dá)細(xì)胞膜上，大部分APP主要定位于高爾基復(fù)合體和反面高爾基體，未從細(xì)胞表面脫落的APP將在數(shù)分鐘內(nèi)從細(xì)胞膜上內(nèi)化，這與APP的C端(也就是異構(gòu)體APP695的682687殘基)存在著“YENPTY”內(nèi)化結(jié)構(gòu)域相關(guān)[22]。隨著內(nèi)化的進(jìn)行，APP被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)涵體進(jìn)行各種分選代謝。

2.1非神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)APP分選及Aβ的產(chǎn)生 APP的內(nèi)化與二級(jí)結(jié)構(gòu)“YENPTY”存在一定的關(guān)系，“YENPTY”的突變將會(huì)導(dǎo)致APP轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)不同的結(jié)果，抑制APP的內(nèi)化可以減少Aβ的產(chǎn)生[33]。此外，許多胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合體也會(huì)為“YENPTY”的超二級(jí)結(jié)構(gòu)提供結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合體包括Fe65、Fe65L1、Fe65L2、Mint 1、Mint 2、Mint 3、Dab1及c-Jun氨基端激酶等蛋白家族成員，過量表達(dá)Mint 1、Mint 2、Fe65將導(dǎo)致APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生和沉積量的減少[34]，暗示這類分子在APP代謝的生理過程中起調(diào)節(jié)作用。

在無極性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，抗淀粉質(zhì)和淀粉質(zhì)處理過程中，APP在ER中合成并經(jīng)歷折疊，隨后進(jìn)入高爾基體中進(jìn)行修飾，再通過分泌囊泡順行運(yùn)輸?shù)竭_(dá)質(zhì)膜，在質(zhì)膜上，APP經(jīng)過ADAM10處理后產(chǎn)生α-CTF(C83)以及sAPPα，C83經(jīng)過γ-secretase處理，得到APP的胞內(nèi)區(qū)域片段及P3蛋白，不能產(chǎn)生完整的Aβ肽[22]，見圖3(A)(B)(C)；而淀粉質(zhì)途徑(將導(dǎo)致Aβ的形成)的過程如下，細(xì)胞表面未受到ADAM10裂解的APP，將與脂筏及BACE1通過BACE1“YENPTY”結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)內(nèi)化，見圖3(D)，其進(jìn)入內(nèi)涵體被BACE1裂解，N端產(chǎn)生可溶性的片段稱為sAPPβ，sAPPβ產(chǎn)生后從膜上脫離，見圖3(E)；C端產(chǎn)生的片段(β-CTF，C99)被拴在膜內(nèi)；隨后γ-secretase 將在溶酶體、細(xì)胞內(nèi)的多囊體、內(nèi)涵體以及細(xì)胞膜上對(duì)C99進(jìn)行水解，產(chǎn)生APP的胞內(nèi)區(qū)域以及不同長度的Aβ片段[5,11]，見圖3(F)。質(zhì)膜也是γ-secretase水解C99的重要部位，見圖3(G)。

Nucleus:細(xì)胞核；ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Golgi：高爾基體；Early endosome:初級(jí)內(nèi)體；Recycling endsome:再循環(huán)內(nèi)體；Lysosomes:溶酶體；Plasma membrane:細(xì)胞膜；MVB(multivesicular body)：多囊體；endocytosis:內(nèi)吞作用；Sorting:分類；Lipid raft：細(xì)胞膜上的脂筏結(jié)構(gòu)；Aβ-monomer:Aβ單體；Aβ-oligomer:Aβ低聚體；γ-secretase：γ-分泌酶；ADAM10:解整合素金屬蛋白酶10；BACE1：β位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白裂解酶1

圖3 APP在細(xì)胞內(nèi)的代謝過程

2.2APP在神經(jīng)元內(nèi)的分選途徑 盡管非神經(jīng)細(xì)胞對(duì)于認(rèn)識(shí)APP的極性分泌和代謝起了重要的作用，例如，ADAM10主要分選至基底外側(cè)質(zhì)膜[35]，但這些研究結(jié)果必須在神經(jīng)元中得到論證，畢竟神經(jīng)細(xì)胞被認(rèn)為是體內(nèi)產(chǎn)生Aβ的主要場所。神經(jīng)元高度分化成胞體、軸突和樹突三大部分，這三大部分均具有不同的功能，因此它們調(diào)節(jié)不同的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的運(yùn)輸，進(jìn)一步細(xì)化分析，軸突和樹突可以再分為許獨(dú)立的空間(樹突軸、樹突小棘、軸突的軸和軸突突觸前末梢等)。一個(gè)復(fù)雜的軌道系統(tǒng)(微管)、運(yùn)輸載體(驅(qū)動(dòng)蛋白和動(dòng)力蛋白)和目的標(biāo)簽(具體分選信號(hào))以此來保證蛋白質(zhì)各自精準(zhǔn)地到達(dá)目的地，一旦干擾到這個(gè)運(yùn)輸系統(tǒng)將會(huì)影響APP代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，導(dǎo)致AD的發(fā)生[36]。

在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，APP的加工受到嚴(yán)格調(diào)控，分泌酶與APP一起通過分泌途徑沿著樹突和軸突運(yùn)輸，并進(jìn)入突觸前小泡[37]，BACE1和APP之間的相互作用發(fā)生在轉(zhuǎn)運(yùn)泡內(nèi)，神經(jīng)元的活性增強(qiáng)這些酶及其底物的再循環(huán)及在體內(nèi)的匯聚。另一方面，活性的γ-secretase定位在末期的循環(huán)內(nèi)體中[38]。與非神經(jīng)細(xì)胞相似，γ-secretase經(jīng)過囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)質(zhì)膜，再通過運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)等方式到達(dá)其活性的亞細(xì)胞部位。Aβ很可能在囊泡內(nèi)產(chǎn)生，然后在胞內(nèi)進(jìn)行處理并到達(dá)前突觸，見圖4。γ-secretase在神經(jīng)元亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的精細(xì)部位(軸突或胞體、樹突內(nèi)體/溶酶體以及樹突或軸突自噬體等)以及在各部位之中產(chǎn)生的含量還有待確定[30]。

(A)APP由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體；(B)高爾基體分離出包含APP的各種分泌囊泡；(C)囊泡可在神經(jīng)元胞體與樹突、軸突之間進(jìn)行運(yùn)輸；Nucleus:細(xì)胞核；Golgi：高爾基體

圖4 APP在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的代謝過程

3 小 結(jié)

APP是Aβ生成的前體蛋白，是AD病理學(xué)的核心。從細(xì)胞生物學(xué)角度深入分析APP的水解過程，不僅能夠說明Aβ產(chǎn)生的詳細(xì)過程，還可以更好地分析治療AD相關(guān)的分泌酶抑制劑。此外，了解三種水解酶的生物學(xué)特征，將為理解Aβ產(chǎn)生過程奠定一定的基礎(chǔ)。Aβ的產(chǎn)生部位很可能位于內(nèi)涵體、溶酶體或質(zhì)膜上，Aβ在質(zhì)膜上產(chǎn)生并與膜相互作用的機(jī)制研究也得到了闡述[39]。目前Aβ產(chǎn)生量較多亞細(xì)胞部位還有待闡明，未來依據(jù)APP的產(chǎn)生和分泌途徑可能找到治療AD的辦法。