王澤雙，劉雅萍，田欣倫，支玉香

(中國醫(yī)學科學院 中國協(xié)和醫(yī)科大學 北京協(xié)和醫(yī)院 a.變態(tài)反應科，b.基礎醫(yī)學研究所醫(yī)學遺傳學系,c.呼吸內(nèi)科，北京 100730)

變應性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)是機體對存在于支氣管內(nèi)的曲霉菌(主要為煙曲霉)產(chǎn)生免疫應答的一種疾病，在部分特發(fā)性哮喘和囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)患者中也普遍存在對煙曲霉敏感的情況，然而僅有2.5%的哮喘患者和9%的CF患者發(fā)展成ABPA[1-2]。ABPA患者在臨床常表現(xiàn)為難以控制的哮喘、肺部浸潤及中央型支氣管擴張等，其癥狀和體征與哮喘和CF相似，臨床易引起誤診或漏診[3]。有研究報道，高達1/3的ABPA患者被誤診為肺結(jié)核、哮喘等疾病[4]。自1952年首例ABPA報道以來[5]，國內(nèi)外學者對ABPA的發(fā)病機制進行了廣泛研究。其中，基于囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)基因多態(tài)性與ABPA發(fā)病之間的關系成為近年的研究熱點。正常情況下，CFTR基因編碼一種名為CFTR的跨膜糖蛋白，其主要功能是維持上皮細胞內(nèi)外的水電解質(zhì)平衡。CFTR的功能異?？蓪е侣入x子轉(zhuǎn)運障礙，表現(xiàn)為慢性鼻竇炎、咳嗽、喘息等呼吸系統(tǒng)癥狀及汗液咸度異常和精子排除不暢等[6]。CF是一種常染色體隱性遺傳病，常見于高加索人，新生兒中CF的發(fā)病率約為1/3 500[7-8]。有研究表明，我國CF患者中檢測到的CFTR基因變異與高加索人有很大差異[9-15]。國外有文獻報道，ABPA患者攜帶CFTR基因變異的比例高于哮喘人群[16]。本研究旨在探討我國ABPA患者CFTR基因變異的特殊性，以及CFTR基因變異在改變ABPA患者臨床癥狀及體征中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年1月至2018年12月于北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科及變態(tài)反應科門診確診的9例漢族ABPA患者作為研究對象，ABPA診斷標準參照2017年中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組編制的《變應性支氣管肺曲霉病診治專家共識》[17]，具體如下。①相關疾病(至少符合1條)：哮喘、支氣管擴張癥、慢性阻塞性肺疾病、非囊性纖維化等。②必需條件(2條均符合)：血清煙曲霉特異性IgE水平升高(>0.35 kUA/L)或煙曲霉皮試速發(fā)反應陽性；血清總IgE水平升高(>1 000 U/mL)。③其他條件(至少符合2條)：外周血嗜酸粒細胞大于0.5×109/L(使用激素者可正常，以往的數(shù)據(jù)可作為診斷條件)；影像學與ABPA一致的肺部陰影(一過性病變包括實變、結(jié)節(jié)、牙膏征或指套征、游走性陰影等，持久性病變包括支氣管擴張、胸膜肺纖維化等)；血清煙曲霉特異性IgG或沉淀素陽性。所有患者無不孕不育病史，出生后無腸梗阻、直腸脫垂等消化道癥狀，其中4例患者經(jīng)汗液電解質(zhì)檢查氯離子水平正常，排除CF。本研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2試驗方法 所有患者采集外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，使用DNA抽提試劑盒(QIAGEN KIT)提取DNA；使用Nanodrop紫外分光光度計對所提取的DNA進行濃度和純度檢測，要求濃度達到30 ng/μL以上，純度在吸光度(A)260/280下為1.8～2.0，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載CFTR基因序列，使用Primer3(Version 0.4.0)軟件設計引物并進行驗證，并經(jīng)過NCBI-BLAST檢測特異性，委托北京天一輝遠生物科技有限公司設計引物。聚合酶鏈反應試劑包括Taq酶(PrimeSTAR GXL)、脫氧核糖核苷三磷酸、緩沖液等，購自日本TAKARA公司。聚合酶鏈反應條件：變性98 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 3 min，×35循環(huán)，16 ℃保溫。聚合酶鏈反應擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的條帶需清晰無雜帶，濃度>30 ng/μL為合格樣品，委托北京天一輝遠生物科技有限公司進行Sanger測序。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找CFTR基因序列信息，并結(jié)合本研究案例采用Chromas Pro 2.1.3軟件對CFTR基因序列進行讀圖分析。

2 結(jié) 果

2.1一般資料分析 本研究納入9例ABPA患者進行基因篩選，其中男4例，女5例，年齡31～67歲，中位年齡為48歲。所有患者均為漢族且無ABPA家族史及血緣關系。本研究中ABPA患者的臨床表現(xiàn)以呼吸系統(tǒng)癥狀為主，其中哮喘6例，咳嗽9例。3例ABPA患者肺功能檢查，第一秒用力呼氣量/用力肺活量比值降低。胸部高分辨CT發(fā)現(xiàn)，肺部條索狀影、管壁增厚等支氣管擴張表現(xiàn)患者4例。9例ABPA患者的一般資料及CFTR基因變異類型見表1。

2.2CFTR基因變異結(jié)果分析 本研究9例患者均利用普通聚合酶鏈反應及Sanger測序進行了CFTR基因區(qū)域的全外顯子測序，其中9例患者均攜帶CFTR基因變異，且所發(fā)現(xiàn)的CFTR基因變異均不是國外常見變異類型。在9例患者中，共發(fā)現(xiàn)c.1408G>A(圖1)、c.2562T>G(圖2)、c.374T>C(圖3)及c.1666A>G(圖4)4種變異類型。

表1 9例ABPA患者的一般資料及CFTR基因變異類型

ABPA：變應性支氣管肺曲霉?。籆FTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子

CFTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子

CFTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子

CFTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子

CFTR：囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子

3 討 論

ABPA一般發(fā)生在具有特異性體質(zhì)的人群，其免疫病理為特異性IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應和特異性IgG介導的Ⅲ型變態(tài)反應。據(jù)報道，在轉(zhuǎn)診中心和二級護理組中，ABPA的患病率分別為13%和0.7%～3.5%[18-19]；而在CF中，ABPA的患病率約為9%[20]。ABPA患者一般均伴有肺功能下降，且與臨床常見的其他呼吸系統(tǒng)疾病較為類似，特別是與哮喘或浸潤性肺結(jié)核容易混淆，其從首次發(fā)病到明確診斷往往需要很多年。本研究中，大多數(shù)患者表現(xiàn)為哮喘和支氣管擴張等癥狀，對臨床診斷容易引起誤導，這與王夢雨等[1]對26例ABPA患者的臨床表現(xiàn)特點分析結(jié)果一致，即認為ABPA在我國較少見且臨床表現(xiàn)缺乏特異性，易誤診為哮喘。因此，加強對該疾病的認識，并尋找有效手段早期識別ABPA具有重要意義。

CFTR基因變異自1989年被發(fā)現(xiàn)與CF有關以來被西方國家廣泛研究[21]，截至目前2 000余種變異被發(fā)現(xiàn)，其中CF患者是CFTR基因突變的主要檢出人群[22]。ABPA患者表現(xiàn)的肺部癥狀與CF的肺部癥狀相似，且CF患者合并ABPA提示ABPA患者中可能存在CF基因的變異。針對高加索人的研究也證實了這種可能性，且在無CF合并癥的ABPA患者中，CFTR基因的雜合變異較常見[2]。

目前，關于我國ABPA患者中CFTR基因變異的研究較少。Miller等[23]對11例ABPA患者和53例慢性支氣管炎患者的CFTR基因多態(tài)性進行了研究，所有納入患者中除ABPA患者中有1例為非洲裔人外，其余均為高加索人。結(jié)果顯示，在11例ABPA患者中有6例患者存在CFTR基因多態(tài)性，其中有1例患者合并有△F508和R347H變異，4例患者存在ΔF508變異，1例患者存在R117H變異，而在53例慢性支氣管炎患者中并未發(fā)現(xiàn)CFTR基因變異，故認為CFTR基因變異在ABPA的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，且ΔF508變異是ABPA患者CFTR基因多態(tài)性的主要類型。與上述研究類似，Marchand等[24]將21例ABPA患者作為觀察組，43例支氣管哮喘和142例健康受試者作為對照組，對兩組受試者的CFTR基因變異情況進行研究。結(jié)果顯示，觀察組有6例(28.6%)存在CFTR基因變異，而對照組僅有8例(4.3%)存在CFTR基因變異，其中支氣管哮喘患者中2例，健康受試者中6例。為進一步闡明CFTR基因多態(tài)性在ABPA發(fā)病過程中的作用，Agarwal等[16]對CFTR基因變異與ABPA的關系進行了薈萃分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組的非ABPA患者相比，ABPA患者CFTR基因變異的風險增加10.39倍，表明ABPA的發(fā)生可能與CFTR基因變異有關，但該研究僅納入4篇文獻，樣本量有限可能會導致結(jié)果出現(xiàn)偏倚。

本研究結(jié)果顯示，9例患者均存在CFTR基因變異。Marchand等[24]對21例ABPA患者CFTR基因變異研究發(fā)現(xiàn)，有6例存在CFTR基因變異，包括13種CFTR基因變異類型。Lebecque等[25]在18例ABPA患者中發(fā)現(xiàn)，有12例患者存在CFTR基因變異。本研究中，9例患者CFTR基因變異類型主要有4種，其中1、2、4、5、8、9號患者均發(fā)現(xiàn)位于11號外顯子區(qū)域的c.1408G>A變異，1、2、5、8號患者均發(fā)現(xiàn)有c.2562T>G變異。所有ABPA患者均未檢測到常見于高加索人的CFTR基因變異類型(F508del、G542X、G511D)。因此，ABPA的發(fā)病可能與CFTR基因變異有關。

有研究證實，在慢性哮喘和慢性鼻竇炎患者中也存在比較高的CFTR基因變異頻率[26-27]。有學者認為，CFTR基因變異是導致呼吸系統(tǒng)疾病的一種重要致病因素[28]；但有研究認為，CFTR基因的雜合變異是機體對抗哮喘的一種保護機制[29-30]。而在ABPA中，其發(fā)病機制可能與多種固有免疫和適應性免疫相關的基因變異有關。有研究認為，CFTR基因多態(tài)性對ABPA的形成作用有限，可能由于某一個等位基因變異導致的黏膜病變使機體屏障功能受損，正常的免疫應答不能正常進行，進而激發(fā)機體免疫系統(tǒng)對曲霉菌產(chǎn)生過激免疫應答[31]，且患者攜帶的CFTR基因變異類型增多，并不會引起CFTR功能發(fā)生較大改變[32]。除CFTR基因多態(tài)性外，人類白細胞抗原(DL2、DR5)、表面活性蛋白A、甘露糖結(jié)合凝集素、Toll樣受體、轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細胞介素-10、白細胞介素-4Rα基因變異引起的ABPA亦有報道[33-35]。

ABPA已被大量試驗證實與很多種固有免疫和適應性免疫相關的基因變異有關，且CFTR基因變異與ABPA發(fā)病具有較強的相關性，我國ABPA患者CFTR基因變異類型可能與國外常見變異類型存在差異。今后需要不斷完善我國基因樣本庫，建立一套適用中國人的CFTR基因變異庫，以對疑似ABPA患者進行基因篩查，為臨床醫(yī)師做出正確診斷提供輔助信息。