葛潔 張月喬 田樹娟 袁黎

摘 要： 減數(shù)分裂是有性生殖的關鍵過程，而西瓜中花粉母細胞的詳細減數(shù)分裂全過程仍未知。以可進行高效穩(wěn)定遺傳轉化的野生型西瓜種質(zhì)‘ZTC的雄花花序為研究材料，采用DAPI熒光染色及壓片技術對西瓜花粉母細胞減數(shù)分裂進程進行了系統(tǒng)觀察研究。結果顯示，西瓜減數(shù)分裂中細胞質(zhì)分裂是同時型的，胞質(zhì)分裂直到第二次減數(shù)分裂結束才發(fā)生，形成四分體。這與大多數(shù)雙子葉植物相同。整個西瓜花粉母細胞減數(shù)分裂遵循雙子葉植物減數(shù)分裂發(fā)育規(guī)律，在整個減數(shù)分裂進程中，減數(shù)第一次分裂前期經(jīng)歷時間較長，減數(shù)第二次分裂前期較短?；趯ξ鞴匣ǚ勰讣毎麥p數(shù)分裂進程與花蕾直徑相關性的分析，可直接從花蕾直徑長度、花藥顏色等外觀形態(tài)學特征來判斷植物體內(nèi)花粉母細胞減數(shù)分裂所處的時期。不僅從細胞生物學水平闡明了西瓜減數(shù)分裂全過程，豐富了西瓜生殖生物學相關研究內(nèi)容，而且進一步為西瓜雜交育種及育性分析等有性生殖生物學研究提供了細胞學理論基礎與技術支持。

關鍵詞：西瓜; 花粉母細胞; 減數(shù)分裂; 生殖發(fā)育

Abstract：? Meiosis is a key process in sexual reproduction. The exact meiosis process of pollen mother cells in watermelon is still unknown. Here， to gain detailed knowledge of watermelon reproduction， especially on meiosis， an efficiency and stable regeneration wild watermelon germplasm ‘ZTC was used as the research material. The meiosis process of watermelon pollen mother cells was observed by DAPI fluorescence staining and chromosome spreadings. The results showed that watermelon meiosis was a simultaneous type， and cytokinesis did not occur until the end of the second meiosis， which was the same as those of most dicotyledonous plants. The whole watermelon meiosis followed the general principles of dicotyledonous plants meiosis development such as prolonged prophase I and indistinguishable prophase II. Based on the analysis of the correlation between the meiosis process of watermelon pollen mother cells and the diameter of flower buds， the meiosis period of pollen mother cells in plants could be determined directly from the morphological features of flower bud diameter and anther color. Our findings provide relatively accurate method for meiotic stage identification in different watermelon varieties and detailed insights of watermelon meiosis， the cytological basis and technical support for the study of watermelon sexual reproduction biology.

被子植物通過雙受精完成生殖過程，雌配子卵細胞和中央細胞分別與精細胞融合發(fā)育成胚和胚乳。二倍體孢子發(fā)育成為單倍體的配子，兩性配子結合，形成合子，再發(fā)育為新個體。開花植物的配子體分別在雌雄花器官中完成有性生殖。在像西瓜這樣的開花植物中，從孢子體期到配子體期的轉變包括2個連續(xù)的過程，孢子發(fā)生和配子體發(fā)生。孢子發(fā)生的特征是花藥原基和胚珠原基中的造孢細胞分別分化成花粉母細胞和胚囊母細胞，單倍體孢子通過連續(xù)有絲分裂發(fā)育為成熟配子體[1-2]。孢子母細胞通過減數(shù)分裂分別產(chǎn)生小孢子（單核花粉粒）和大孢子（單核胚囊），小孢子發(fā)育為有1個營養(yǎng)細胞和2個精細胞的成熟花粉粒（雄配子體），大孢子（單核胚囊）發(fā)育為成熟的七細胞八核胚囊（雌配子體）[3]。

減數(shù)分裂在植物生命周期中維持遺傳穩(wěn)定性和豐富變異性方面起著重要作用。在第一次減數(shù)分裂過程中，同源染色體發(fā)生配對（聯(lián)會），在這一聯(lián)會過程中，同源染色體的非姐妹染色單體交叉互換完成基因重組[4]。減數(shù)分裂使染色體減半，植物將從二倍體世代轉換到單倍體世代。在第二次減數(shù)分裂中，姐妹染色單體將移動到細胞的兩極，形成新的小孢子或大孢子。減數(shù)分裂時發(fā)生的同源染色體配對和染色體重組將豐富物種的遺傳變異。減數(shù)分裂后，減數(shù)分裂產(chǎn)生的單核孢子將繼續(xù)有絲分裂，形成精細胞和卵細胞[5]。受精后精細胞和卵細胞融合形成合子，恢復物種的原始染色體數(shù)目，這將在植物繁殖過程中保持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定。減數(shù)分裂是植物提高環(huán)境適應和繁殖能力的關鍵步驟。

西瓜（Citrullus lanatus （Thunb.） Matsum. & Nakai）是一種具有很高商業(yè)價值的在世界廣泛栽培的的園藝作物，是一種典型的雙子葉植物，大多雌雄同株，在同一株植物上分別開雄花和雌花。西瓜生殖發(fā)育，尤其是減數(shù)分裂，對其繁殖、營養(yǎng)形態(tài)建成和產(chǎn)量至關重要。然而迄今為止，減數(shù)分裂過程只在少數(shù)物種中被系統(tǒng)研究過，包括擬南芥、水稻和豇豆等[6-9]。目前有關西瓜細胞遺傳學、有性生殖生物學的研究明顯滯后，關于葫蘆科作物系統(tǒng)的減數(shù)分裂進程研究仍未見報道。筆者對高效可穩(wěn)定遺傳轉化的野生型西瓜種質(zhì)‘ZTC的減數(shù)分裂過程進行了研究，并根據(jù)花蕾的形態(tài)指標總結出一套生殖日歷，以期根據(jù)生殖器官（如花蕾）的表型特征確定減數(shù)分裂的時期，更好地對作物進行田間管理，對不同西瓜材料減數(shù)分裂進行預測，并為減數(shù)分裂相關基因突變分析提供關鍵時期的劃分和鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

野生型種質(zhì)‘ZTC，屬于東亞生態(tài)型，生長于34～35° N，108～109° E，關中平原與黃土高原過渡坮塬區(qū)域。土壤環(huán)境為少沙化的黃褐土，抗旱性強且具備一定的抗炭疽病能力。‘ZTC可進行高效穩(wěn)定的遺傳轉化，能為今后的遺傳育種研究奠定分子生物學基礎，因此選擇野生型西瓜種質(zhì)‘ZTC為材料展開研究。試驗材料于2018年3—7月在西北農(nóng)林科技大學園藝學院楊凌西甜瓜試驗示范基地的塑料大棚內(nèi)種植。試驗地處關中平原， 位于34°25′N，108°20′E，屬暖溫帶半濕潤氣候帶。試驗大棚的長度、跨度、高度分別為140.0、9.0、2.8 m，土壤類型為關中塿土，pH值為7.0～8.5，耕層0～20 cm。土壤養(yǎng)分狀況為有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)9.96 g·kg-1，全氮質(zhì)量分數(shù)1.28 g·kg-1，速效磷質(zhì)量分數(shù)50.00 mg·kg-1，速效鉀質(zhì)量分數(shù)179.24 mg·kg-1。當西瓜進入生殖生長階段，即植物生長點處長出不同大小的花蕾時，采集這些花蕾，于卡諾固定液（V乙醇∶V乙酸=3∶1）中固定。花蕾在固定液中固定至少12 h，然后用皮下注射針和鑷子切開，取花藥用于樣品制備。

1.2 壓片法制片展開染色體

花粉母細胞減數(shù)分裂的染色體壓片法在先前建立的方法基礎上進行些許改進[6]。采集的花蕾在卡諾試劑中固定至少12 h，用游標卡尺測量花蕾大小;體視顯微鏡下解剖出花蕾內(nèi)部的花藥部分，置于載玻片上，加10 mmol·L-1檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5）洗滌3次;花藥組織加入混合酶液（1.4%β-葡聚糖醛酸苷酶，0.3%纖維素酶，0.3%果膠酶）15 μL，37 ℃恒溫箱酶解3 h;酶解完全的花藥材料取出置于常溫，吸干酶液，水洗3次;水洗滌后的組織用鑷子捏碎，加入13 μL的60%冰醋酸使細胞透明化;透明化的花藥材料蓋上蓋玻片，用拇指用力按壓蓋玻片;將制好的裝片放入-80 ℃冰箱至少10 min;取出裝片，掀開蓋玻片，室溫下干燥;干燥后的樣品用1.5 mg·mL-1 4，6-二氨基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI，Vector Laboratories， Inc. Burlingame， CA）染色。在奧林巴斯熒光顯微鏡（奧林巴斯BX 63）下觀察減數(shù)分裂細胞，并使用Spot RT imaging （Diagnostic Instruments， Inc.）拍照。

1.3 花蕾直徑的測量

對于花蕾大小，最大橫向直徑被用作寬度指標，測量工具為游標卡尺。以西瓜花蕾的橫徑作為減數(shù)分裂關鍵過程的參數(shù)，建立生殖日歷。

2 結果與分析

2.1 野生型西瓜減數(shù)分裂過程

減數(shù)分裂是植物生殖細胞形成的關鍵步驟。孢子母細胞發(fā)育到一定時期便進入減數(shù)分裂時期。減數(shù)分裂過程較為復雜，可以分為第一次減數(shù)分裂和第二次減數(shù)分裂，減數(shù)分裂I和減數(shù)分裂II都可以進一步分為前期、中期、后期和末期。

‘ZTC是高效可穩(wěn)定遺傳轉化的野生型西瓜種質(zhì)（圖 1），對光周期敏感，對干旱半干旱地區(qū)有很強的適應性，并且在與其他常見生態(tài)型如‘97103的比較當中發(fā)現(xiàn)，‘ZTC的生殖發(fā)育過程極具代表性。在西瓜中，每朵雄花有3個花藥（圖 1-B）。為了研究花粉母細胞減數(shù)分裂染色體行為，減數(shù)分裂時期的細胞通過酶解從花藥中釋放出來;DAPI染色在熒光顯微鏡下觀察染色體形態(tài)（圖 2）。

減數(shù)分裂前期I經(jīng)歷時間長，染色體變化復雜，根據(jù)染色體的細胞學特征，可以進一步分為5個亞階段，即細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期[10-13]。在前期I的初期，染色體開始凝聚并盤繞，逐漸形成細線狀，上面分布著許多大小不同的球狀染色體;染色體最終附著在核膜的一部分，呈花束狀向另1個方向擴散，這個亞階段被稱為細線期（圖 2-A）。父本的一條染色體和母本的另一條染色體具有相似的特征、大小和遺傳順序，稱為同源染色體。絲狀染色體逐漸靠攏（圖 2-B），染色體相互連接和交叉，表明同源染色體開始配對，這種現(xiàn)象被稱為聯(lián)會。聯(lián)會是染色體之間廣泛而穩(wěn)定的相互作用，包括形成一種叫做聯(lián)會復合體的復雜蛋白質(zhì)結構[14]。當同源染色體是部分配對時，配對的染色體明顯地“融合”在一起，沒有完成配對的染色體分離開（圖 2-B），這表明減數(shù)分裂細胞處于偶線期。

當同源染色體完全聯(lián)會后，減數(shù)分裂細胞進入粗線期，每對配對完全的同源染色體進一步縮短變粗，呈粗線狀結構（圖2-C）。在粗線期中期，由于聯(lián)會，細胞核中的染色體對被稱為二價體。每個二價體包含4條染色單體，也稱為四分體（不同于小孢子成熟時形成的四分體）。此時，二價體中不同染色體的染色單體之間，可能在1個或幾個位置交叉，并且發(fā)生染色單體片段的交換和重組，而另外2條染色單體保持不變。染色體互換現(xiàn)象被稱為交換，這對生物體遺傳和變異具有重要意義（圖 2-C）。

粗線期后，染色體繼續(xù)濃縮，緊密配對的同源染色體開始分離，但發(fā)生交換的地方仍然連接在一起，因此聯(lián)會染色體呈現(xiàn)X、V、8和0的形狀（圖 2-D），這個亞期被稱為雙線期。

隨后染色體進一步濃縮，高度緊密的二價體進入終變期。從圖 2-E可以看出，染色體高度濃縮成點，這個時期是觀察和計算染色體數(shù)目的最佳時期。前期I結束。

當染色體螺旋化凝聚達到最大值時，二價染色體呈點狀線性排列在細胞中間的赤道板上（圖 2-F）。這一階段被稱為中期I，紡錘體將著絲粒拉向兩極，使同源染色體分離并移動到相對的兩極（圖 2-G），這一階段被稱為后期I，后期I結束后每個極區(qū)的染色體數(shù)量只有原來母細胞的一半。后期I之后的時期是末期I，當染色體到達兩極時，西瓜染色體在細胞中解螺旋展開，核膜組重新包裹染色體（圖 2-H） 。

西瓜的第二次減數(shù)分裂緊接著第一次減數(shù)分裂之后，分裂間期非常短。染色體在前期II重新螺旋縮短（圖 2-I），2組染色體被中間的細胞板隔開。進入中期II，2組染色體分別排列在赤道板上（圖 2-J）。隨后在后期II，姐妹染色單體彼此分離，形成了4個新染色體簇（圖 2-K）。在末期II，染色體解螺旋產(chǎn)生4個單倍體子細胞（圖 2-L），通過胞質(zhì)分裂四分體中的細胞各自分離，發(fā)育形成4個單核小孢子。

從完整的西瓜減數(shù)分裂（圖 2）可以看出，第1次核分裂不伴有細胞質(zhì)分裂，只形成雙核細胞，沒有出現(xiàn)二分體階段。胞質(zhì)分裂直到第二次減數(shù)分裂結束時才發(fā)生，此時形成了4個子細胞（四分體）。因此，西瓜的減數(shù)分裂中細胞質(zhì)分裂是同時型，與大多數(shù)雙子葉植物的減數(shù)分裂相同。

2.2 花蕾直徑與減數(shù)分裂進程的對應關系

對不同大小的花蕾的生殖發(fā)育階段進行分類。表 1顯示了對應于不同直徑大小的花蕾，其內(nèi)部生殖細胞在減數(shù)分裂不同時期數(shù)量的百分比。西瓜的減數(shù)分裂發(fā)生在直徑為1.4～3.4 mm的花蕾中（表 1）。在1.4～1.6 mm的花蕾中，減數(shù)分裂I開始。由表 1可以看出，不同大小的花蕾均可對應1個明顯的減數(shù)分裂階段。例如，在1.6～1.8 mm的花蕾中，統(tǒng)計花蕾中所有生殖細胞，71.6%處于偶線期，25.5%處于細線期，2.9%處于粗線期，由此可見，偶線期為1.6～1.8 mm花蕾的代表時期。此外，相同或相似大小的花蕾中的生殖細胞均處于相同或相鄰的階段，這種現(xiàn)象與植物生殖生長的同步發(fā)育規(guī)律相一致。例如，當花蕾的直徑為2.2～2.4 mm時，內(nèi)部生殖細胞處于雙線期和終變期，除此之外沒有其他時期。因此，花蕾大小可以作為減數(shù)分裂時期的指標來預測減數(shù)分裂的相對發(fā)育階段。

前期I與減數(shù)分裂其他時期相比相對較長（表 1），表現(xiàn)為直徑1.4～2.6 mm花蕾中的生殖細胞仍處于前期I，這也是植物生殖過程中的常見現(xiàn)象。在前期I，同源染色體相互配對以及遺傳物質(zhì)發(fā)生交換和重組，豐富了物種遺傳性的變異。中期I和后期I都較為短暫，其中當花蕾發(fā)育到直徑大小為2.4～3.0 mm時，生殖細胞處于中期I和后期I這2個階段。染色體在很短的時間內(nèi)移向兩極，完成染色體數(shù)目的減半。此外，在整個減數(shù)分裂時期花藥組織的生殖細胞中，處于前期II的生殖細胞數(shù)目較少（表1），證明前期II也較短，生殖細胞在經(jīng)歷末期I后很快進入中期II。

2.3 雄性配子體發(fā)育的生殖日歷

如圖 3和表 2所示，雄性生殖細胞減數(shù)分裂可以與花蕾的橫向直徑相關聯(lián)，開始于1.4 mm大小的花蕾，止于3.4 mm大小的花蕾。如圖 3和表 1所示，從花粉母細胞到成熟單核花粉粒的形成，所有減數(shù)分裂事件都與花蕾大小相關。因此，建立的生殖日歷是根據(jù)不同花蕾直徑大小，從而判斷其內(nèi)部生殖細胞減數(shù)分裂的具體時期。

‘ZTC減數(shù)分裂始于1.4～1.6 mm的花蕾內(nèi)。染色體首先開始凝聚，形成細線狀結構，這表明花粉母細胞在前期I很早就進入細線期（圖 3-A，表 2）。當花蕾長到1.6～1.8 mm時，同源染色體部分開始配對，這一時期稱為偶線期（圖 3-B，表 2）?；ɡ贆M徑長到1.8～2.0 mm，同源染色體物完全配對完成，出現(xiàn)1個粗線狀結構，稱為粗線期（圖 3-C，表 2）。當花蕾的直徑達到2.0～2.2 mm時（圖 3-D，表 2），染色體呈X、V、8和0的形狀，當花蕾的直徑達到2.2～2.4 mm時（圖 3-E，表 2），染色體進一步濃縮呈點狀分布。這2個時期分別為雙線期和終變期。前期I在花蕾直徑達到2.6 mm時結束。

紡錘絲牽引染色體，在花蕾直徑為2.4～2.6 mm時染色體呈線狀排列在赤道板上，對應的時期為中期I （圖 3-F，表 2）。由于染色體向兩極分離，2.6～2.8 mm的花蕾對應于后期I（圖 3-G，表 2）。當花蕾直徑為2.8～3.0 mm時，進入末期I （圖 3-H，表 2）。

相對應的，第二次減數(shù)分裂的花蕾直徑在2.4～3.4 mm（圖 3，表 2）。前期II、中期II和后期II的花蕾直徑大小差異不明顯，說明減數(shù)分裂II時期相對較短。細胞中的2組染色體在2個赤道板上分別線性排列，這一時期為中期II，對應的花蕾直徑大小為3.0～3.2 mm（圖 3-I，表 2）。當花蕾直徑為3.0～3.2 mm時，姐妹染色單體發(fā)生分離，然后在后期II形成四組新染色體簇（圖 3-I，表 2）。在末期II階段，花蕾直徑通常達到3.2～3.4 mm。染色體解螺旋發(fā)生，并進一步產(chǎn)生4個單倍體子細胞（圖 3-J，表 2），通過胞質(zhì)分裂形成4個小孢子。

3 討論與結論

西瓜是世界第五大新鮮果品，是我國重要的經(jīng)濟作物。西瓜細胞遺傳學、生殖生物學研究對于育性分析、品種改良、遺傳育種等研究有明顯的指導作用。然而，目前有關西瓜細胞遺傳學、有性生殖生物學研究明顯滯后，迄今為止，減數(shù)分裂過程只在少數(shù)物種中被系統(tǒng)研究過，包括擬南芥、水稻和豇豆等[6-9]。關于葫蘆科作物系統(tǒng)的減數(shù)分裂進程研究仍未見報道。

筆者首次對西瓜的減數(shù)分裂進程及花藥外觀形態(tài)的相關性進行了較為系統(tǒng)的觀察研究，結果對西瓜細胞遺傳學及生殖生物學研究都有重要意義。研究結果表明，西瓜花粉母細胞經(jīng)過2次分裂，最終形成4個子細胞。其中減數(shù)分裂第1次分裂（減I期）又可進一步分為前期I、中期I、后期I和末期I 4個時期。前期I相對經(jīng)歷時間最長，對應花蕾直徑從1.4 mm開始，至2.6 mm結束。中期I，配對的同源染色體向兩極分離，進入后期I和末期I，最終形成2個染色體數(shù)目減半的子細胞。子細胞繼續(xù)進行減數(shù)分裂第2次分裂（減II期），同樣經(jīng)歷前、中、后、末4個時期，直至形成四分體，減數(shù)分裂結束。第二次減數(shù)分裂相較第1次來說，時間較短，對應花蕾直徑為2.4～3.4 mm。西瓜減數(shù)分裂過程遵循大多數(shù)被子植物減數(shù)分裂規(guī)律[15-17]，因此，屬于西瓜減數(shù)分裂與大多數(shù)被子植物減數(shù)分裂各個時期的共性特征。

除減數(shù)分裂共性特征外，筆者還發(fā)現(xiàn)西瓜花粉母細胞的減數(shù)分裂行為存在一些特殊行為。一般情況下，花粉母細胞減數(shù)分裂在藥室應表現(xiàn)出同步現(xiàn)象。然而，在供試材料的同一花藥的壓片中觀察發(fā)現(xiàn)，花粉母細胞減數(shù)分裂進程中，同樣直徑的花蕾壓片結果，卻觀察到2～7個不同的減數(shù)分裂時期（表 1）。尤其，是直徑為2.4～2.6 mm的花蕾壓片結果表明，34.1%的花粉母細胞處于中期I，有22.2%的細胞仍在終變期，卻有12.2%的細胞已經(jīng)發(fā)育到了后期II。減數(shù)分裂時期的不同步性，造成了四分體形成的不同步，最終導致雄配子體形成的不同步。究其原因，這種減數(shù)分裂進程的不同步性或差異，有可能是由于西瓜種間遺傳特性不同造成的，也不排除取樣時天氣狀況以及取樣時間等外界環(huán)境因素造成的差異。也有研究表明，自然機制（如無融合生殖）或影響孢子發(fā)生的特定突變也會造成減數(shù)分裂時期和染色體形態(tài)的不同步或重大差異[18-20]。然而，這種減數(shù)分裂進程的不同步性在一定程度上延長了花期，可降低外界極端環(huán)境對散粉或減數(shù)分裂的影響而增加授粉幾率，增強了種群繁殖能力，是一種生物適應環(huán)境的進化機制[21-23]。但是，造成減數(shù)分裂不同步的具體原因及機制目前尚不清楚，還有待進一步研究。

本研究結果還表明，西瓜花粉母細胞減數(shù)分裂進程與其花蕾的外部形態(tài)或者直徑存在一定的相關性。因此，可通過西瓜雄花花蕾的外部形態(tài)或直徑對其減數(shù)分裂時期進行判斷，此結果不僅在西瓜有性生殖生物學、細胞遺傳學等研究中具有實際應用價值，也為西瓜育種、品種改良等技術提供了細胞學理論基礎。然而，在實際應用中，由于西瓜種屬間的差別、生長地區(qū)及環(huán)境的不同，以及花蕾采集時間、發(fā)育時期不同等等多方面因素的影響，花粉母細胞減數(shù)分裂進程與花蕾外部形態(tài)之間可能存在一定的差異。因此，需要結合臨時壓片觀察花粉母細胞減數(shù)分裂進程，同時結合相關性分析進行綜合判斷，以達到降低外界因素影響、相對準確地確定減數(shù)分裂具體時期的目的。

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