周珂，嚴(yán)鵬程，胡永丹*

1(昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明，650500) 2(昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院，云南 昆明,650500)

紅曲色素是紅曲菌代謝過(guò)程中形成的聚酮類化合物[1]，主要有黃、橙、紅3種色調(diào)[2]，具有抗氧化[3]、抗肥胖[4]、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血脂[5]以及抑制阿爾茨海默病[6]的功效，在食品、釀酒、保健品等行業(yè)均有廣泛應(yīng)用。其中紅色素的生產(chǎn)工藝已十分成熟，而橙、黃色素因其良好的感官性能，來(lái)源天然以及不受季節(jié)、地域性限制等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的發(fā)展?jié)摿徒?jīng)濟(jì)潛能，因此成為天然色素產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的新方向。

然而在紅曲菌的發(fā)酵過(guò)程中，桔霉素常常伴隨紅曲色素的合成而產(chǎn)生。桔霉素有損害肝臟代謝、致畸[7]、致癌和致突變的作用[8]，并可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制[9]，這使得紅曲產(chǎn)品的食用安全性受到挑戰(zhàn)，限制了它的應(yīng)用。目前，降低桔霉素含量主要是通過(guò)篩選菌株、基因工程及控制發(fā)酵條件3種方法[10]。已有學(xué)者通過(guò)菌株篩選獲得了低產(chǎn)桔霉素的紅曲菌株[11]。此外，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件也能夠控制紅曲的生長(zhǎng)情況[12]，以及利用低頻磁場(chǎng)能夠抑制桔霉素的產(chǎn)生[13]。本研究通過(guò)改變紅曲菌液態(tài)發(fā)酵條件(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件)，研究紅曲色素和桔霉素在紅曲菌中的積累規(guī)律[14]，通過(guò)外部調(diào)控選擇安全有效的培養(yǎng)方式，為紅曲色素的安全應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

紅曲菌株(MonascuspurpureusZH2)，由江南大學(xué)固態(tài)發(fā)酵研究室提供。

1.1.2 試劑

葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米漿干粉、酵母膏,南京茂捷微生物科技有限公司；馬鈴薯、大米粉、糯米粉,市售；桔霉素(標(biāo)準(zhǔn)品),上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、磷酸,天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙腈,上海星可高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

1.1.3 主要儀器設(shè)備

RXZ-288A人工氣候箱，寧波江南儀器廠；LS-30立式壓力蒸汽滅菌器，上海東亞壓力容器制造有限公司；QYC-2102全溫培養(yǎng)搖床，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司；T9CS雙光束紫外可見(jiàn)光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1260高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

將紅曲菌接種于PDA斜面，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7 d，4 ℃保藏。

制備孢子懸浮液：用無(wú)菌水洗下PDA斜面上的紅曲菌孢子，然后用玻璃珠將菌團(tuán)打散后過(guò)濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子數(shù)達(dá)到1×(107～108)個(gè)/mL。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，大豆水解液60，蛋白胨10，NaNO31.0，MgSO4·7H2O 2.0，KH2PO45.0，ZnSO40.02，pH自然。在28 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)48 h。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨10，NaNO33.0，初始pH自然。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 不同碳源對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

采用葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、大米粉、糯米粉，分別設(shè)置40、50、60 g/L三個(gè)梯度，氮源統(tǒng)一為蛋白胨，無(wú)機(jī)鹽為KH2PO4和K2HPO4，pH自然。250 mL三角瓶裝液50 mL，經(jīng)121 ℃滅菌20 min，接種10%種子培養(yǎng)基，每組樣品做3個(gè)平行，在28 ℃，180 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.2.2 不同氮源對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

可溶性淀粉作為碳源，添加量為60 g/L，(NH4)2SO4、NH4Cl、蛋白胨、玉米漿干粉、酵母膏、NaNO3為氮源，分別設(shè)置10、20、30 g/L 3個(gè)梯度，無(wú)機(jī)鹽及培養(yǎng)條件同上。

1.2.2.3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加KH2PO4、K2HPO4、MgSO4(1.0、2.0、3.0 g /L)、ZnSO4(0.05、0.1、0.15 g/L)、MnSO4(0.1、0.2、0.3 g /L)。培養(yǎng)條件同上。

1.2.2.4 復(fù)合添加無(wú)機(jī)鹽對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

以添加K2HPO4的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，在此基礎(chǔ)上分別將MgSO4、MnSO4、ZnSO4設(shè)計(jì)成不同的添加組合，各種無(wú)機(jī)鹽的添加量與1.2.2.3優(yōu)化出的單因素添加量一致。培養(yǎng)條件同上。

1.2.2.5 不同溫度對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，K2HPO4添加量為2 g/L，接種量為8%，將接種好的搖瓶分別放置在18、23、28、33 ℃的條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.2.6 不同裝液量對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，K2HPO4添加量為2 g/L，接種量為8%，分別向250 mL錐形瓶中添加50、60、70、80、90、100、110、120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.2.7 不同pH對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，K2HPO4添加量為2 g/L，接種量為8%，裝液量為50 mL/250 mL，初始pH用HCl和NaOH調(diào)至2、3、4、5、6、7、8，在28 ℃條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.2.8 不同轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，K2HPO4添加量為2 g/L，接種量為8%，裝液量為50 mL/250 mL，初始pH為3，將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為160、180、200、220 r/min，在28 ℃條件下培養(yǎng)5 d。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 測(cè)定色價(jià)

將發(fā)酵液研磨破碎后取1 mL于25 mL比色管中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容至25 mL，顛倒混勻，置于60 ℃恒溫水浴中浸提40 min。浸提結(jié)束后，取出冷卻至室溫，用乙醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)，并以70%乙醇為空白對(duì)照，在全波長(zhǎng)掃描下找出橙、黃色素的最大吸收峰，得到黃、橙色素的OD值。通過(guò)公式(1)、(2)計(jì)算色價(jià)：

黃色價(jià)/(U·mL-1)=OD410×總稀釋倍數(shù)

(1)

橙色價(jià)/(U·mL-1)=OD470×總稀釋倍數(shù)

(2)

1.3.2 測(cè)定菌體干重

將濾紙烘干至恒重，精確稱量濾紙的質(zhì)量。充分混合后精確量取30 mL發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，濾渣用蒸餾水充分洗滌數(shù)遍后，55 ℃烘干至恒重，精確稱量濾渣及濾紙的總質(zhì)量。

1.3.3 桔霉素含量測(cè)定

將發(fā)酵液經(jīng)破碎后取5 mL置于15 mL比色管中，并用同體積的甲醇定容至10 mL，超聲萃取30 min后于8 000 r/min下離心10 min，然后將提取液微濾后用HPLC分析檢測(cè)桔霉素含量。

HPLC色譜條件：流動(dòng)相，V(0.1%磷酸水)∶V(乙腈)=66∶34；VWD檢測(cè)器λ=330 nm；色譜柱5 μm，Agilent XDB Reversed-phase C18；柱長(zhǎng)及柱徑250 mm×4.6 mm；體積流量1.0 mL/min；溫度30 ℃；標(biāo)準(zhǔn)樣及樣品進(jìn)樣量均為20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

顯著性差異分析使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)的方法(IBM SPSS Statistics 20，NY，USA)。數(shù)據(jù)作圖使用Origin 8.5(Originlab corporation，Inc.MA，USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 300～600 nm內(nèi)的波長(zhǎng)掃描

按照1.3.1方法對(duì)發(fā)酵提取液進(jìn)行可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定橙、黃色素所在的波長(zhǎng)范圍，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯觯?10 nm和470 nm附近有明顯的吸收峰，分別為黃色素和橙色素。

圖1 紅曲菌液態(tài)發(fā)酵色素提取液的光譜掃描圖

2.2 碳源對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

由表1可知，葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉促進(jìn)紅曲菌ZH2色素生長(zhǎng)的效果相對(duì)明顯。可溶性淀粉作為碳源時(shí)，紅曲菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生淀粉酶和糖化酶將淀粉緩慢分解，從而使發(fā)酵液中的單糖濃度維持在一定水平，不會(huì)造成菌體快速地大量生長(zhǎng)，有利于紅曲色素的產(chǎn)生和積累。而高濃度的葡萄糖作為碳源時(shí)，會(huì)產(chǎn)生乙醇，從而抑制菌體的生長(zhǎng)和色素的合成[15]。當(dāng)蔗糖作為碳源時(shí)，菌體成大塊團(tuán)狀，與培養(yǎng)基接觸面積過(guò)小，導(dǎo)致菌體缺乏營(yíng)養(yǎng)，不利于色素的積累。麥芽糖和葡萄糖為碳源時(shí)，桔霉素質(zhì)量濃度最高達(dá)到7.15、8.35 μg/mL，可溶性淀粉質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)，桔霉素含量最低，為5.91 μg/mL，所以選擇60 g/L可溶性淀粉為紅曲菌ZH2發(fā)酵的碳源。

2.3 氮源對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

以60 g/L可溶性淀粉作為碳源，分析氮源對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響。由表2可知，不同種類及濃度的氮源對(duì)紅曲菌ZH2的橙黃色素產(chǎn)量、菌絲干重、桔霉素的含量影響差異較大，表現(xiàn)出無(wú)機(jī)氮源整體優(yōu)于有機(jī)氮源。(NH4)2SO4等無(wú)機(jī)氮源更適合橙黃色素生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)殇@鹽作為氮源被消耗時(shí)，降低了發(fā)酵液pH值，使發(fā)酵體系處于酸性環(huán)境中，影響相關(guān)代謝酶活性，抑制桔霉素生成或加速其作為中間代謝產(chǎn)物的分解，促進(jìn)紅曲黃色素生物合成[16]。

表1 不同碳源對(duì)紅曲菌ZH2生長(zhǎng)的影響

注：大寫(xiě)字母、小寫(xiě)a、a1、a2等字母分別代表各種類間黃色價(jià)、橙色價(jià)、菌絲干重、桔霉素含量的顯著性差異(P<0.05)(下同)

表2 不同氮源對(duì)紅曲菌ZH2生長(zhǎng)的影響

當(dāng)有機(jī)氮源作為紅曲菌的氮源時(shí)，會(huì)被紅曲菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶分解成多種氨基酸，從而與紅曲橙色素發(fā)生反應(yīng)，將橙色素轉(zhuǎn)變成水溶性紅色素。而無(wú)機(jī)氮源中不含氨基酸類物質(zhì)，所以不會(huì)出現(xiàn)上述現(xiàn)象。當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，黃色素含量最高，菌體生長(zhǎng)狀況良好，且桔霉素含量為7.011 μg/mL，處于較低水平。結(jié)合顯著性差異分析，選擇(NH4)2SO410 g/L作為紅曲菌ZH2發(fā)酵的最佳氮源及添加量。通過(guò)氮源的優(yōu)化選擇，發(fā)酵液由之前的棕紅色變成了明顯的橙黃色。

2.4 外加無(wú)機(jī)鹽對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

以可溶性淀粉及(NH4)2SO4作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源，添加不同的無(wú)機(jī)鹽到發(fā)酵培養(yǎng)基中，產(chǎn)生的色素色價(jià)各有不同，其中 KH2PO4和K2HPO4比其他幾種無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵產(chǎn)生的橙、黃色素優(yōu)勢(shì)明顯，這是因?yàn)镵H2PO4和K2HPO4能夠作為培養(yǎng)基的緩沖體系，維持并穩(wěn)定培養(yǎng)基在紅曲菌代謝過(guò)程中的pH。由表3可知，添加K2HPO4比KH2PO4產(chǎn)生的桔霉素含量要少，在質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)，橙、黃色價(jià)分別達(dá)到113.51 U/mL，79.63 U/mL，桔霉素含量為6.82 μg/mL。從原材料的來(lái)源及貯存等方面考慮，選用K2HPO4為紅曲菌ZH2發(fā)酵的無(wú)機(jī)鹽。

磷酸鹽在微生物生長(zhǎng)和代謝調(diào)節(jié)中，具有重要的生理功能，但在合成產(chǎn)物的過(guò)程中還需要一些無(wú)機(jī)離子的參與[17]。以添加K2HPO4的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，在此基礎(chǔ)上分別添加MgSO4、MnSO4、ZnSO4、MnSO4+ZnSO4、MgSO4+ZnSO4、MgSO4+MnSO4、MgSO4+MnSO4+ZnSO4等不同無(wú)機(jī)鹽組合，考察復(fù)合無(wú)機(jī)鹽對(duì)紅曲生長(zhǎng)的影響。由表3可知，添加了2 g/L的MgSO4和0.02 g/L的ZnSO4組合生產(chǎn)色素的能力最高，橙、黃色素色價(jià)分別達(dá)到119.28 U/mL，94.38 U/mL，相對(duì)應(yīng)的桔霉素含量為7.10 μg/mL。綜上所述，將2.0 g/L K2HPO4、2.0 g/L MgSO4及0.02 g/L ZnSO4作為紅曲菌ZH2的外加無(wú)機(jī)鹽。

表3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)紅曲菌ZH2生長(zhǎng)的影響

注：后7組中無(wú)機(jī)鹽的添加量(g/L)分別為MgSO42；MnSO40.04；ZnSO40.02；MnSO40.04+ZnSO40.02；MgSO42+ZnSO40.02；MgSO42+MnSO40.04；MgSO42+MnSO40.04+ZnSO40.02

2.5 溫度對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，在18～28 ℃的溫度范圍下，隨著溫度升高，橙、黃色素色價(jià)升高。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，發(fā)酵液的色價(jià)最大，橙、黃色素色價(jià)分別為59.06 U/mL，38.56 U/mL；溫度超過(guò)30 ℃，發(fā)酵液的色價(jià)明顯降低，原因可能是因?yàn)闇囟葘?duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成及代謝的影響是多方面的，不僅可以改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，而且會(huì)影響細(xì)胞代謝過(guò)程中各種關(guān)鍵酶的活性[18]。過(guò)高或過(guò)低的溫度，不利于菌體的生長(zhǎng)和色素的積累，從桔霉素含量可以看出，在28 ℃下桔霉素含量最低，達(dá)到5.70 μg/mL，故選擇28 ℃為培養(yǎng)的最適溫度。

圖2 溫度對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

2.6 裝液量對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

從圖3可以看出，隨著裝液量的增加，橙、黃色素產(chǎn)量逐漸降低，菌絲干重逐漸減少，說(shuō)明裝液量越大，越不利于紅曲菌的生長(zhǎng)[19]。這是因?yàn)榧t曲菌是好氧菌，在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下，裝液量越少其通氣量越大，溶氧量越多，有利于菌體生長(zhǎng)以及產(chǎn)生色素等代謝產(chǎn)物。同時(shí)裝液量不同，桔霉素的含量差別較大，在50～100 mL時(shí)，桔霉素逐漸增加，直到裝液量為110 mL時(shí)，桔霉素含量隨有所降低，但仍高于50 mL時(shí)的桔霉素含量。裝液量為50 mL時(shí)，橙、黃色素分別達(dá)到85.50 U/mL，83.63 U/mL，菌絲干重更多，說(shuō)明該條件下更有利于菌體的生長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的桔霉素含量最低，僅為5.73 μg/mL，故選擇50 mL為最佳裝液量。

2.7 不同pH對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，中性環(huán)境促進(jìn)紅曲菌產(chǎn)色素的能力不夠突出；中性偏酸環(huán)境有利于紅曲菌產(chǎn)色素，菌體得率也較高，過(guò)酸環(huán)境既不利于菌體的生長(zhǎng)也不利于色素的生成；在堿性環(huán)境下菌體基本不生長(zhǎng)，色價(jià)也很低[20]。綜上，過(guò)酸或堿性環(huán)境都不利于色素的生長(zhǎng)積累，當(dāng)pH 3～4時(shí)，菌體生長(zhǎng)良好，總色價(jià)較高，發(fā)酵液顏色較深，其中pH 3的效果最好，紅曲菌產(chǎn)色素的最適pH應(yīng)該最接近3[21]。pH為3時(shí)，橙、黃色素含量分別達(dá)到75.63 U/mL，107.00 U/mL，而且其相對(duì)應(yīng)的桔霉素含量為6.43 μg/mL，低于產(chǎn)色素能力相近的pH 4所對(duì)應(yīng)的桔霉素含量8.27 μg/mL，所以選擇pH 3作為紅曲菌ZH2發(fā)酵的初始pH。

圖4 不同pH對(duì)紅曲菌ZH2產(chǎn)紅曲色素的影響

2.8 不同轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)的影響

由圖5可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，橙、黃色素色價(jià)逐漸增大，在200～220 r/min時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。轉(zhuǎn)速越大，通氣量越大，紅曲菌的溶氧就越大，從而越有利于菌體生長(zhǎng)，但是轉(zhuǎn)速過(guò)大，雖能增加溶氧量，但會(huì)因剪切力過(guò)大，對(duì)菌絲的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致色素的生長(zhǎng)能力降低[19]。由圖5看出，在200 r/min和220 r/min條件下的色素產(chǎn)量相當(dāng)，但后者的菌體生長(zhǎng)量達(dá)到最大，且桔霉素含量低于200 r/min時(shí)，所以選擇220 r/min作為培養(yǎng)的最佳轉(zhuǎn)速。在此條件下，紅曲菌ZH2的橙、黃色素色價(jià)分別達(dá)到152.96、108.38 U/mL，桔霉素含量為5.80 μg/mL。

圖5 不同轉(zhuǎn)速對(duì)紅曲菌ZH2生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)紅曲菌ZH2進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到了在搖床水平下發(fā)酵紅曲菌ZH2高產(chǎn)紅曲色素、低產(chǎn)桔霉素的最佳培養(yǎng)基配方：碳源為可溶性淀粉60 g/L，氮源為(NH4)2SO410 g/L，無(wú)機(jī)鹽K2PO42.0 g/L，MgSO42.0 g/L，ZnSO40.02 g/L；最適的發(fā)酵條件為溫度28 ℃，裝液量50 mL/250 mL，初始pH 3，轉(zhuǎn)速220 r/min，發(fā)酵5 d。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，發(fā)酵液中橙、黃色素由最初的18.59 U/mL，24.54 U/mL分別提高到152.96 U/mL，108.38 U/mL，桔霉素含量由最初的8.35 μg/mL減少到5.80 μg/mL，降低了30%。