張建成 林淑琴 胡鵬飛

膿毒癥是由感染引起的高死亡率全身炎癥反應綜合征[1]。脂多糖（LPS）誘導的心肌損傷是膿毒癥患者死亡的主要原因，病死率高達90%[2-3]。LPS 誘導膿毒癥大鼠心肌功能發(fā)生障礙，心肌組織氧化水平升高，細胞凋亡增多[4]。自噬作為細胞內(nèi)降解損傷細胞器、冗余蛋白質的主要方式之一，調(diào)控細胞凋亡生理進程[5]。LPS 處理心肌細胞，細胞凋亡及自噬水平顯著升高，心肌收縮功能異常[6]。丹參多糖（SMP）是丹參的有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗凋亡等生理功效[7-8]。丹參顯著改善缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞凋亡，改善心功能[9]。長期口服SMP 增強內(nèi)源性抗氧化劑和抗高血脂活性，對異丙腎上腺素誘導的大鼠心臟損傷具有顯著的保護作用[10]。提示SMP 可能對LPS 誘導的膿毒癥心肌細胞損傷有保護作用，但目前尚未見報道。本文通過分離SD 大鼠心肌細胞，探究SMP 對LPS 誘導的心肌細胞損傷的調(diào)節(jié)機制。

1 實驗材料

1.1 動物 12 月齡健康雄性實驗清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠20 只，體質量250～300g，浙江省實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK（浙）2018-0012，倫理批號：2018154，動物房保持通風，干燥，室溫22～25℃，濕度維持在50%～70%，自由飲水，鼠料定量喂養(yǎng)，動物飼養(yǎng)及實驗操作嚴格遵守實驗動物的使用和管理原則。

1.2 試劑 DMEM/F12（Gibco，#12 400024），GAPDH（Cell Signaling Technology，#5174T）、Bax（Cell Signaling Technology，#2772）、Caspase3（Cell Signaling Technology，#9662）、cleaved-Caspase3（Cell Signaling Technology，#9664）、LC3（Cell Signaling Technology，#3868）和Beclin1（Cell Signaling Technology，#3738），CQ（北京華美互利生物化工，#54057），Torin1（碧云天，#SC0245），Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天，#C1062S），MTT 試劑盒（上海威奧生物有限公司，#WH1197）。

2 實驗方法

2.1 SMP 制備 取丹參（廣銳生物，#1490）2kg，碾碎呈粉末，加入15 倍量水，20℃下進行攪拌提取，每次0.5h，重復2 次。真空干燥濾液獲得SMP。

2.2 大鼠心肌細胞分離與培養(yǎng) 大鼠心肌細胞分離方法參考文獻[11]報道。大致過程：取出生1～2 天大鼠心臟，生理鹽水（PBS）沖3 次，取心室肌剪碎，含0.125%胰蛋白酶的PBS 消化4 次，每次15min。添加10%胎牛血清終止消化。250g/min，離心8min，加入含10%胎牛血清DMEM/F12 復蘇。復蘇的細胞在10cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12h，使非心肌細胞（主要是心肌成纖維細胞）黏附在塑料上，細胞用含1%溴脫氧尿苷DMEM 培養(yǎng)48h。消化離心收取心肌細胞，-80℃凍存。

2.3 大鼠心肌細胞分組及SMP 處理方法 將大鼠心肌細胞分為五組：對照組、LPS 組、0.5mg/mL SMP干預組、1mg/mL SMP 干預組和2mg/mL SMP 干預組。LPS 組：終濃度1μg/mL LPS 刺激大鼠心肌細胞24h；SMP 干預組：不同濃度SMP 預處理大鼠心肌細胞12h，然后用1μg/mL LPS 刺激24h；對照組：加入等量生理鹽水。

2.4 MTT 檢測SMP 對心肌細胞活力的影響 5000個心肌細胞種植于96 孔板，分為五組：對照組、LPS組、0.5mg/mL SMP 干預組、1mg/mL SMP 干預組和2mg/mL SMP 干預組。處理24h 后，加入5%MTT，37℃培養(yǎng)箱中孵育1h，分光光度計在450nm 波長下測定細胞吸光度改變，統(tǒng)計存活率，進行3 次獨立重復實驗。

2.5 流式細胞儀檢測SMP 對心肌細胞凋亡的影響心肌細胞種植于6 孔板，分為五組：對照組、LPS 組、0.5mg/mL SMP 干預組、1mg/mL SMP 干預組和2mg/mL SMP 干預組。處理24h 后，胰酶消化制成0.1mL 的含2×105單細胞懸液，預冷的70%乙醇4℃固定2h。離心棄去固定液，3mLPBS 重懸，清洗3 次。1mL PI 染液染色，4℃避光30min。流式細胞儀檢測細胞凋亡比例，進行3 次獨立重復實驗，統(tǒng)計細胞凋亡比例。

2.6 Western blot 檢測SMP 處理的心肌細胞自噬及凋亡相關蛋白改變 心肌細胞分為五組：對照組、LPS 組、0.5mg/mL SMP 干預組、1mg/mL SMP 干預組和2mg/mL SMP 干預組。處理24h 后，收集細胞蛋白，BCA 測定蛋白含量，高溫加熱蛋白變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF），轉膜結束后，5%脫脂牛奶封閉常溫孵育1h，按一抗?jié)舛菳ax（1：10000）、Caspase3（1：1000）、cleaved -Caspase3（1：1000）、LC3（1：5000）、Beclin1（1：5000）和GAPDH（1：10000）孵育一抗，4°C孵育過夜，洗膜液洗3 次，每次15min，二抗?jié)舛龋?：10000）孵育2h，洗膜液洗3 次，每次15min，化學發(fā)光法（ECL）顯影，凝膠成像系統(tǒng)檢測Bax、Caspase3、cleaved-Caspase3、LC3 和Beclin1 蛋 白 表 達，以GAPDH 為內(nèi)參。進行3 次獨立重復實驗。

2.7 SMP 調(diào)控自噬對心肌細胞存活率的影響 將大鼠心肌細胞分為五組：對照組、LPS 組、LPS+2mg/mL SMP 干預組、LPS+2mg/mL SMP+氯喹（CQ）干預組和LPS+2mg/mL SMP+Torin1 干預組。LPS 組：終濃度1μg/mL LPS 刺激大鼠心肌細胞24h；LPS+2mg/mL SMP 干預組：2mg/mL SMP 預處理大鼠心肌細胞12h，然后用1μg/mL LPS 刺激24h；LPS+2mg/mL SMP+CQ 干預組：2mg/mL SMP 和50μM CQ 預處理大鼠心肌細胞12h，然后用1μg/mL LPS 刺激24h；LPS+2mg/mL SMP+Torin1 干預組：2mg/mL SMP 和250nM Torin1 預處理大鼠心肌細胞12h，然后用1μg/mL LPS 刺激24h；對照組：加入等量生理鹽水。

2.8 MTT 檢測SMP 調(diào)控自噬對心肌細胞活力的影響 5000 個心肌細胞種植于96 孔板中，分為五組：對照組、LPS 組、LPS+2mg/mL SMP 干預組、LPS+2 mg/mL SMP+CQ 干預組和LPS+2mg/mL SMP+Torin1干預組。加入5%MTT，37℃培養(yǎng)箱中孵育1h，分光光度計在450nm 波長下測定細胞吸光度改變，統(tǒng)計存活率，進行3 次獨立重復實驗。

2.9 流式細胞儀檢測SMP 調(diào)控對心肌細胞凋亡的影響 心肌細胞種植于6 孔板，分為五組：對照組、LPS 組、LPS+2mg/mL SMP 干 預 組、LPS+2mg/mL SMP+CQ 干預組和LPS+2mg/mL SMP+Torin1 干預組。胰酶消化制成0.1mL 的含2×105單細胞懸液，預冷的70%乙醇4℃固定2h。離心棄去固定液，3mL PBS 重懸，清洗3 次。1mL PI 染液染色，4℃避光30min。流式細胞儀檢測細胞凋亡比例，進行3 次獨立重復實驗，統(tǒng)計細胞凋亡比例。

2.10 Western blot 檢測SMP 調(diào)控自噬對LPS 處理的心肌細胞自噬及凋亡相關蛋白改變 心肌細胞分為五組：對照組、LPS 組、LPS+2mg/mL SMP 干預組、LPS+2mg/mL SMP+CQ 干預組和LPS+2mg/mL SMP+Torin1 干預組。收集細胞蛋白，BCA 測定蛋白含量，高溫加熱蛋白變性，進行SDS-PAGE，轉移到PVDF，轉膜結束后，5%脫脂牛奶封閉常溫孵育1h，按一抗?jié)舛菳ax（1：10000）、Caspase3（1：1000）、cleaved-Caspase3（1：1000）、LC3（1：5000）、Beclin1（1：5000）和GAPDH（1：10000）孵育一抗，4°C 孵育過夜，洗膜液洗3 次，每次15min，二抗?jié)舛龋?：10000）孵育2h，洗膜液洗3 次，每次15min，ECL 顯影，凝膠成像系統(tǒng)檢 測Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase3、LC3 和Beclin1 蛋白表達，以GAPDH 為內(nèi)參。進行3 次獨立重復實驗。

2.11 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗重復3 次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析和t 檢驗比較組間差異。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 SMP 對LPS 誘導的心肌細胞存活率的影響 與對照組比較，LPS 處理的心肌細胞活力顯著降低（P＜0.01）；與LPS 組比較，SMP 預處理顯著抑制LPS 誘導的心肌細胞活力降低，且隨著SMP 濃度增大，細胞活力顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

3.2 SMP 對LPS 誘導的心肌細胞凋亡的影響 與對照組比較，LPS 處理心肌細胞，細胞凋亡比例顯著升高（P＜0.01），與LPS 組比較，SMP 預處理顯著抑制LPS 誘導的心肌細胞凋亡，且隨著SMP 濃度增大，細胞凋亡比例顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），見表2、圖1。

表1 SMP 對LPS 處理的心肌細胞存活率的影響（%，±s）

表1 SMP 對LPS 處理的心肌細胞存活率的影響（%，±s）

注：n=3 代表3 次獨立重復實驗；LPS 為脂多糖；SMP 為丹參多糖；與對照組比較，aaP＜0.01；與LPS 組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

表2 SMP 對LPS 誘導心肌細胞凋亡率的影響（%，±s）

表2 SMP 對LPS 誘導心肌細胞凋亡率的影響（%，±s）

注：n=3 代表3 次獨立重復實驗；LPS 為脂多糖；SMP 為丹參多糖；與對照組比較，aP＜0.01；與LPS 組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.3 SMP 對LPS 處理的心肌細胞自噬和凋亡蛋白表達的影響 與對照組比較，LPS 處理心肌細胞，細胞促凋亡相關蛋白Bax 和Cleaved-Caspase3 表達增多，自噬相關蛋白Beclin1 和LC3II 蛋白表達增多，表明LPS 誘導心肌細胞自噬。與LPS 組比較，SMP 預處理顯著抑制LPS 誘導的心肌細胞Bax 和Cleaved-Caspase3 蛋白表達，促進Beclin1 和LC3II 蛋白表達進一步增加，表明SMP 可能參與LPS 誘導的自噬和凋亡途徑，見圖2。

圖1 SMP 抑制LPS 誘導的心肌細胞凋亡

圖2 SMP 對LPS 誘導的心肌細胞自噬和凋亡蛋白表達的影響

3.4 SMP 促進自噬抑制LPS 誘導的心肌細胞活力下降和細胞凋亡 與對照組比較，LPS 處理心肌細胞后，細胞活力明顯降低（P＜0.01）；SMP+LPS 組比較，SMP+CQ+LPS 組細胞活力下降，SMP+Torin1+LPS組細胞活力升高（P 均＜0.01）；流式結果表明，與SMP+LPS 組比較，SMP+CQ+LPS 組細胞凋亡增多，SMP+Torin1+LPS 組細胞凋亡減少（P 均＜0.05）。見表3～4、圖3。

表3 SMP 促進自噬抑制LPS 誘導細胞活力（%，±s）

表3 SMP 促進自噬抑制LPS 誘導細胞活力（%，±s）

注：n=3 代表3 次獨立重復實驗；LPS 為脂多糖；SMP 為丹參多糖；CQ為氯喹；與對照組比較，aaP＜0.01；與LPS 組比較，bbP＜0.01；與SMP+LPS 組比較，cP＜0.05

表4 SMP 促進自噬抑制LPS 誘導的細胞凋亡率（%，±s）

表4 SMP 促進自噬抑制LPS 誘導的細胞凋亡率（%，±s）

注：n=3 代表3 次獨立重復實驗；LPS 為脂多糖；SMP 為丹參多糖；CQ為氯喹；與對照組比較，aaP＜0.01；與LPS 組比較，bbP＜0.01；與SMP+LPS 組比較，cP＜0.05

3.5 SMP 促進自噬抑制LPS 誘導的心肌細胞促凋亡蛋白表達 與SMP+LPS 組比較，SMP+CQ+LPS 組Bax、cleaved-Caspase3 和LC3II 表達增多，Beclin1 表達減少，SMP+Torin1+LPS 組，Bax、cleaved-Caspase3、LC3II 和Beclin1 表達增多，表明SMP 促進自噬抑制LPS 誘導的心肌細胞促凋亡蛋白表達。見圖4。

圖3 SMP 促進自噬抑制LPS 誘導的細胞凋亡

圖4 SMP 調(diào)控自噬參與LPS 誘導的細胞凋亡

4 討論

心肌損傷作為膿毒癥的重要病征，導致多器官衰竭。LPS 誘導的膿毒癥小鼠發(fā)生心肌缺血損傷，促凋亡蛋白表達增多[12]。自噬作為機體重要生理過程，在膿毒癥心肌損傷中發(fā)揮重要功能。心肌細胞自噬升高減輕心肌梗死引起的心肌損傷，增強心肌細胞自噬對心肌細胞線粒體損傷有保護作用。米諾環(huán)素通過增強心肌細胞線粒體自噬和心肌細胞自噬，改善心肌功能[13]。LPS 處理肺上皮細胞，自噬水平隨著LPS 處理時間的延長，顯著增加[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，LPS 處理心肌細胞，細胞自噬及凋亡水平顯著升高，表現(xiàn)為自噬相關蛋白表達增加，凋亡細胞比例增多，細胞活力下降。

SMP 作為丹參的主要成分，現(xiàn)已廣泛應用于免疫性肝損傷、腫瘤及高血壓等疾病研究[15-16]。經(jīng)SMP預處理后，暴露于H2O2的大鼠心肌細胞H9C2 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性下降，丙二醛（MDA）升高，抑制線粒體功能障礙、增強抗氧化和抗凋亡能力[17]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠心肌細胞經(jīng)SMP 預處理，LPS 誘導的細胞凋亡減少，細胞活力升高，促凋亡蛋白表達減少，同時伴隨自噬水平升高。另一方面，我們通過自噬抑制劑或激活劑聯(lián)合SMP 預處理LPS 誘導的心肌細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)SMP 促進自噬抑制LPS 誘導的心肌細胞損傷。

綜上所述，LPS 誘導膿毒癥心肌細胞發(fā)生嚴重的細胞凋亡，導致心肌損傷加重。SMP 通過增強自噬抑制LPS 誘導的心肌細胞損傷，發(fā)揮心肌保護作用。