葉曉鷗

目前，胰腺癌唯一的治愈手段為手術(shù)切除[1]，但由于患者確診時(shí)，體內(nèi)常伴有胰腺癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除往往無法完全根治[2]。吉西他濱配合化療是胰腺癌的主要治療方式，但化療耐藥會(huì)阻礙吉西他濱發(fā)揮藥效[3]。在臨床上丹參二萜醌類被用來治療心血管疾病[4]，且其化合物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[5]。本研究觀察丹參二萜醌類化合物隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮抗胰腺癌AsPC-1，BxPC-3細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌AsPC-1 細(xì)胞、BxPC-3 細(xì)胞均采購于中科院上海細(xì)胞所。隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）分子式為C19H20O3，相對分子質(zhì)量296.35，采購于Selleck（中國上海藍(lán)木化工有限公司）（批次S 228502）。丹參新酮（miltirone）分子式為C19H22O2，相對分子質(zhì)量282.382，由浙江省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室尹一飛老師饋贈(zèng)。去氫丹參新酮（dehydromiltirone）分子式為C19H20O2，相對分子質(zhì)量280.367，由浙江省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室尹一飛老師饋贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞用含10% gibco 胎牛血清RPMI1640 培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖能力 常規(guī)培養(yǎng)胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞，并按照不同濃度的隱丹參酮（0、5、10、15、30、50μM）、丹參新酮（0、5、10、15、20、30μM）、去氫丹參新酮（0、5、10、15、20、30μM）分別進(jìn)行處理。加入CCK-8 并在培養(yǎng)箱中孵育后，檢測吸光度值（OD 值），并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 PI/Annexin-V 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 按照AsPC-1 組和BxPC-3 組進(jìn)行分組，組內(nèi)分別設(shè)置有空白對照組、隱丹參酮組（30μM）、丹參新酮組（15μM）、去氫丹參新酮組（15μM），分別作用于對數(shù)生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞24h，經(jīng)AnnexinV-FITC/PI 染色后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western blot 檢測PKC 同工酶磷酸化 隱丹參酮組（30μM）和空白對照組；丹參新酮組（15μM）和空白對照組；去氫丹參新酮組（15μM）和空白對照組分別作用于對數(shù)生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3細(xì)胞4h 后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白Western blot檢測PKC 信號通路相關(guān)位點(diǎn)的磷酸化水平。

1.6 SiRNA 轉(zhuǎn)染 對AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞進(jìn)行siRNA 轉(zhuǎn)染，以沉默PKCδ。轉(zhuǎn)染后siRNA 的陰性對照組為si-nc 組，成功沉默PKCδ thr505 位點(diǎn)的細(xì)胞設(shè)置為siRNA 組，并將未經(jīng)任何處理的的細(xì)胞設(shè)置為空白組（con）。按照上述分組分別將處于對數(shù)期的細(xì)胞接種于6 孔板中于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h 后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白Western bloting 法檢測PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點(diǎn)的磷酸化情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及Dunnett t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮顯著抑制胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞增殖 不同濃度的隱丹參酮（0、5、10、15、30、50μM）、丹參新酮（0、5、10、15、20、30μM）、去氫丹參新酮（0、5、10、15、20、30μM）作用對數(shù)生長期的胰腺癌AsPC-1、BxPC-3、Panc-1、MIAPaCa-2 細(xì)胞24h 后CCK-8 法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，隱丹參酮濃度為30μM 時(shí)AsPC-1 細(xì)胞存活率為（40.1±5.0）%，BxPC-3 細(xì)胞存活率為（36.2±5.4）%，Panc-1 細(xì)胞存活率為（89.3±6.5）%，MIAPaCa-2 細(xì)胞存活率為（92.2±4.9）%；丹參新酮濃度為15μM 時(shí)AsPC-1 細(xì)胞存活率為（52.1±5.1）%，BxPC-3 細(xì)胞存活率為（47.2±5.7）%，Panc-1 細(xì)胞存活率為（95.3±5.5）%，MIAPaCa-2 細(xì)胞存活率為（93.2±5.9）%；去氫丹參新酮為15μM 時(shí)AsPC-1 細(xì)胞存活率為（46.1±5.0）%，BxPC-3 細(xì)胞存活率為（42.2±5.4）%，Panc-1 細(xì)胞存活率為（92.3±4.8）%，MIAPaCa-2 細(xì)胞存活率為（91.2±4.3）%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮對As－PC-1、BxPC-3 細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度及時(shí)間依賴性（P＜0.01）。

2.2 隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮顯著促進(jìn)胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞凋亡發(fā)生 按照As－PC-1 組和BxPC-3 組進(jìn)行分組，組內(nèi)分別設(shè)置有空白對照組、隱丹參酮組（30μM）、丹參新酮組（15μM）、去氫丹參新酮組（15μM），分別作用于對數(shù)生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞24h，經(jīng)AnnexinV-FITC/PI 染色后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，空白對照組、隱丹參酮組、丹參新酮組、去氫丹參新酮組分別作用于對數(shù)生長期的胰腺癌AsPC-1 細(xì)胞24h，細(xì)胞的凋亡率分別為（4.6±3.4）%、（29.1±4.6）%、（50.3±7.1）%、（41.2±4.3）%；空白對照組、隱丹參酮組、丹參新酮組、去氫丹參新酮組分別作用于對數(shù)生長期的胰腺癌BxPC-3 細(xì)胞24h，細(xì)胞凋亡率分別為（5.3±4.8）%、（29.5±4.2）%、（32.1±5.4）%、（51.9±4.5）%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對于空白對照組，隱丹參酮組、丹參新酮、去氫丹參新酮均能顯著促進(jìn)胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞凋亡發(fā)生，且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮顯著抑制胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞PKD1 ser916、PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點(diǎn)的磷酸化 隱丹參酮組（30μM）和空白對照組；丹參新酮組（15μM）和空白對照組；去氫丹參新酮組（15μM）和空白對照組分別作用于對數(shù)生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3細(xì)胞4h 后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白Western blot法檢測PKC 信號通路相關(guān)位點(diǎn)的磷酸化水平。結(jié)果顯示，隱丹參酮組、丹參新酮組、去氫丹參新酮組PKD1 ser916、PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點(diǎn)的磷酸化水平均下調(diào)，其它PKC 蛋白磷酸化水平未發(fā)生明顯變化（見圖1）。

2.4 隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮均能在1h內(nèi)顯著抑制胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點(diǎn)磷酸化 隱丹參酮組（30μM）、丹參新酮組（15μM）、去氫丹參新酮組（15μM）分別按照0、30min、1、2、4h 的時(shí)間梯度作用于對數(shù)生長期的胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白Western blot 法檢測PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點(diǎn)的磷酸化情況。結(jié)果顯示，隱丹參酮下調(diào)AsPC-1 細(xì)胞PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點(diǎn)磷酸化在作用2h 后效果顯著，對BxPC-3 細(xì)胞p-PKCδ thr505、p-PKD1 ser744/748 的下調(diào)作用則在30min～1h 時(shí)有明顯效果；丹參新酮、去氫丹參新酮?jiǎng)t均能在1h 顯著抑制胰腺癌AsPC-1和BxPC-3 細(xì)胞PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點(diǎn)磷酸化（見圖2）。

2.5 SiRNA 沉默處理胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞PKCδ 后，PKD1 ser744/748 位點(diǎn)磷酸化水平明顯下調(diào) 對AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞進(jìn)行siRNA 轉(zhuǎn)染，以沉默PKCδ。轉(zhuǎn)染后siRNA 的陰性對照組為si-nc組，成功沉默PKCδ thr505 位點(diǎn)的細(xì)胞設(shè)置為siRNA 組，并將未經(jīng)任何處理的細(xì)胞設(shè)置為空白組（con）。按照上述分組分別將處于對數(shù)期的細(xì)胞接種于6 孔板中于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h 后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白Western bloting 法檢測PKCδ thr505、PKD1 ser744/748 位點(diǎn)的磷酸化水平。結(jié)果顯示，siRNA 沉默胰腺癌AsPC-1、BxPC-3 細(xì)胞PKCδ 后，胰腺癌AsPC-1、BxPC-3 細(xì)胞PKD/PKCμ ser744/748 的磷酸化水平下調(diào)（見圖3）。

圖1 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測PKC 相關(guān)位點(diǎn)磷酸化水平

圖2 Western blot 檢測PKCδ 和PKD1 磷酸化水平

圖3 Western blot 檢測經(jīng)過siRNA 轉(zhuǎn)染后AsPC-1、BxPC-3細(xì)胞PKC 相關(guān)位點(diǎn)磷酸化水平

3 討論

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是一組由單一多肽鏈組成的磷脂依賴性Ca2+激活的蛋白絲氨酸/蘇氨酸。前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，PKC 在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等諸多方面都起到重要作用，研究表明，PKC 能夠被具有促腫瘤增殖作用的佛波脂所激活，提示PKC 在腫瘤的增殖過程中可能起重要作用，因此被認(rèn)為可能是腫瘤治療中的一個(gè)新靶點(diǎn)[6]。研究表明，PKCδ 特異性抑制劑能顯著性抑制胰腺癌Panc-l 和結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞的腫瘤再增殖；PKCα 調(diào)節(jié)的肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力通過p38 信號通路介導(dǎo)[7]；PKCβII 選擇性抑制劑betalIV5-3 能夠減少人前列腺癌內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成[8]；而PKCδ 的激活則引起促進(jìn)腫瘤形成的SHH 信號通路及非經(jīng)典的Writ 信號通路的活化[9]。

文獻(xiàn)報(bào)道，PKD/PKCμ SER916 位點(diǎn)可以作為監(jiān)測PKD 活性的指標(biāo)[10]，當(dāng)p-PKD/PKCμ SER916 的表達(dá)受到抑制時(shí)，p-PKCδ thr505/p-PKD1 ser744/748 的表達(dá)會(huì)同時(shí)受到抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隱丹參酮（30μM）、丹參新酮（15μM）、去氫丹參新酮（15μM）分別作用于胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞24h 后，p-PKD1 SER916 的水平均有下調(diào)，以此推測p-PKCδ thr505/p-PKD1 ser744/748 信號通路在該過程中發(fā)揮作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明，p-PKCδ 水平受到抑制，并因此下調(diào)PKD1 ser744/748 的磷酸化。

綜上所述，隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮均能抑制p-PKCδ thr505 的表達(dá)，繼而p-PKD/PKCμ ser744/748 表達(dá)下調(diào)，從而顯著促進(jìn)胰腺癌AsPC-1 和BxPC-3 細(xì)胞凋亡發(fā)生。已有文獻(xiàn)報(bào)道PKD1 ser744/748 的磷酸化可以調(diào)控JNK 信號通路[11]，因此推測隱丹參酮、丹參新酮、去氫丹參新酮通過調(diào)控PKD1-JNK 信號通路，抑制胰腺癌AsPC-1 和Bx－PC-3 細(xì)胞的增殖。