陳恩就 周方聯(lián) 陳 勝 鄭 哲

肺癌的高度惡性生物學行為與肺癌組織中存在少量肺癌干細胞（Lung cancer stem cells，LCSCs）具有自我更新、多向分化潛能以及更強體內成瘤能力密切相關[1-2]。二氫楊梅素（DMY）是一種從美國蔓藤中提取的黃酮醇類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降壓和抗血栓形成等多種藥理學活性[3-4]。同時DMY還可抑制肺癌、肝癌和胃癌等多種惡性腫瘤生長，對正常細胞影響較小，但DMY 是否對惡性腫瘤干細胞發(fā)揮抗腫瘤作用尚未有文獻報道[5-7]。本研究探討DMY 體外對LCSCs 的影響及其作用機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人肺癌細胞株（PC9 和H1299）以及人正常肺上皮細胞株16HBE 購于美國模式培養(yǎng)物保存中心（ATCC）。

1.2 藥品及試劑 DMY 購自美國Sigma 公司，批號SML0295；DMEM 高葡萄糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司，批號61 870044；凋亡檢測試劑盒和細胞計數(shù)-8（CCK-8）試劑盒購自上海Biyuntian公司，批號C0038；BCA 蛋白質濃度測定試劑盒和RIPA 裂解物購自北京中山生物工程有限公司，批號分別為C503061 和BDIT0037；SOX2、OCT4、ABCG2、Axin2、Survivin 抗體購自Cell Signaling 公司，批號分別為 2748、2750、42078、5863、2803；Wnt1、cyclin D、Total-LRP6、phospho-LRP6、Total-STAT3、phos－pho-STAT3（Tyr705）、phospho-STAT3（ser727）、OCT4、C-Myc、Nanog 和β-actin 抗體購自美國Santa Cruz公司，批號分別為LM14876、LM11868、LBP77206、LBP69476、LM17883、LBP86316、LBP75572、LM17473、LM11591、LM12592、LM11530。

1.3 器材與設備 3111 型CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司；RM2135 型切片機和HI1220 型烘片機購自Leica 公司；BH2 型倒置顯微鏡購自Olympus 公司；1681130-4B 型酶標儀、Mini-Proten Tetra System 型電泳系統(tǒng)購自Bio-Rad 公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) PC9、H1299 及16HBE 細胞均運用DMEM 培養(yǎng)液進行培育，同時在DMEM 培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清，細胞放置細胞培養(yǎng)箱環(huán)境中，使用含EDTA 胰蛋白酶消化，按照1：3 的比例進行傳代。PC9 和H1299 細胞轉移到不含血清的MEM-F12 無酚紅培養(yǎng)基中以提取LCSCs，培養(yǎng)基中添加20ng/mL的bGFG、20ng/mL 的EGF 以及20mg/mL 的B27。

2.2 配制DMY 溶液 把100mg 的DMY 添加至10mL 的DMSO 內，制備得到10mg/mL 的母液，隨后妥善放置4℃環(huán)境中，臨使用時將母液置于37℃水浴箱內溶解后再添加DMEM 培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，0.1%為DMSO 在DMY 溶液中濃度的上限，0.1%DMSO 對細胞活力無顯著抑制作用。使DMY 梯度濃度為5、10、25、50、100、200μmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 CCK-8 法檢測細胞活力 PC9 或H1299 細胞加入96 孔板中，每孔中分配2×104個細胞，藥物處理后放在37℃環(huán)境中4h，隨后將10μL 的CCK-8 試劑添加至每個96 孔板的孔中，借助酶標儀對吸光度數(shù)值（OD）進行檢測和記錄。

2.4 流式細胞分析細胞凋亡 將PC9 或H1299 細胞濃度設定成5×106/mL，細胞懸液通過PBS 完成3次清洗后放置在70%乙醇溶液中固定12h，離心后用PBS 液重懸細胞，在細胞中加入2.5μL annexin V試劑（20μg/mL）和50μL binding buffer 在室溫下避光反應30min，再添加5μL PI 和100μL binding buffer 在室溫下避光反應5min，借助流式細胞儀完成細胞凋亡檢測，該步驟反復進行3 次，計算平均值。

2.5 干細胞培養(yǎng) PC9 或H1299 細胞經不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30 天后，在DMEM-F12 培養(yǎng)基中可見懸浮的干細胞球，將3 代以后的干細胞球經胰酶消化和離心后獲得細胞懸液，在倒置顯微鏡下觀察并拍攝照片。

2.6 蛋白質印跡法（Western blot）細胞在細胞裂解液的作用下提取蛋白，總蛋白離心后收集上清液（1300rpm，4℃，10min），用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白（30g）進行十二烷基硫酸酯-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并將其電轉移到PVDF 膜上，5%的BSA 阻斷硝酸纖維素膜后再通過I 抗、II 抗反應，使用增強型化學發(fā)光試劑盒完成顯色、曝光等處理。

2.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據以均數(shù)±標準差表示，組間差異通過ANOVA 方差Dunnett-t 方法分析，設立P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 DMY 對體外PC9 和H1299 細胞活力和凋亡的影響 將依次升高濃度的DMY（5～200μmol/L）分別作用肺癌PC9 和H1299 細胞及正常肺上皮16HBE細胞24h 后，CCK-8 法測定細胞活力，結果表明，較低濃度DMY（5～100mmol/L）對體外16HBE 細胞的生長無明顯抑制作用，最高濃度（200mmol/L）的DMY作用16HBE 細胞后僅使細胞存活率從100%（對照組）降低到（68.71±11.83）%，100mmol/L 的DMY 對約85%的16HBE 細胞無明顯的毒性，表明濃度不超過100mmol/L 的DMY 對正常細胞生長幾乎無影響，而PC9 和H1299 細胞對DMY 的敏感性明顯高于16HBE 細胞。CCK-8 實驗結果顯示，（25～200mmol/L）DMY 可有效抑制體外肺癌細胞株PC9 和H1299活力，呈濃度依賴關系（見圖1）。流式細胞術結果示，DMY（25mmol/L）作用體外肺癌PC9 和H1299細胞24h 后，可顯著誘導肺癌細胞凋亡，與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）見圖2。

3.2 DMY 對體外PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 成球能力的影響 濃度為25μmol/L 的DMY 分別作用PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 24h 后，在光學顯微鏡下可以觀察到LCSCs 的成球能力顯著下降，表現(xiàn)為干細胞腫瘤球體積明顯縮小以及細胞球數(shù)量顯著減少，見圖3。

3.3 DMY 抑制LCSCs 的機制 應用Western blot法測定兩種LCSCs 干細胞參與自我更新轉錄因子（Nanog、OCT4 和SOX2）以及Wnt/β-catenin 通路相關蛋白（β-catenin、Wnt1、p-LRP6、Axin2、Survivin、cylin D、p-STAT3（Tyr705）和p-STAT3（ser727）表達量。Western blot 結果顯示，DMY 顯著降低PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 中Nanog、OCT4 和SOX2 蛋白的表達（見圖4A）。DMY 作用后PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs β-catenin、Wnt1、Axin2、Survivin 和cyclin D 表達均下調，另外DMY 作用后LCSCs 中STAT3 在Tyr705 位點的磷酸化程度減少，而DMY不影響STAT3 在Ser727 位點的磷酸化水平，見圖4B。

圖1 CCK-8 法測定DMY 對體外肺癌PC9 和H1299 細胞及16HBE 細胞活力的影響

圖2 流式細胞術檢測PC9 和H1299 細胞凋亡

圖3 光學顯微鏡下觀察PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 的形態(tài)注：DMY 為二氫楊梅素；DC9 為人肺癌PC9 細胞株；H1299為人肺癌H1299 細胞株；LCSCs 為肺癌干細胞

圖4 Western bolt 法測定

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度（5～100μmol/L）的DMY 對體外16HBE 細胞生長無明顯抑制作用，但PC9 和H1299 細胞對DMY 的生長抑制效應更加敏感，25μmol/L 的DMY 即可有效抑制體外PC9 和H1299細胞生長，并誘導細胞凋亡，表明DMY 對肺癌細胞的生長抑制作用是有效和安全的，與既往文獻所報道的DMY 對小鼠肝臟無明顯損傷作用結果相仿[7]。隨后本研究分選出OCT4 及SOX2 陽性表達肺癌細胞，并經干細胞表型實驗鑒定其為LCSCs。DMY 作用后可以抑制體外LCSCs 懸浮細胞球的體積和數(shù)量，同時抑制LCSCs 中干細胞標志物（Nanog、OCT4 和SOX2）的表達，這些數(shù)據有力地支持了DMY 可以作為一種有效的LCSCs 抑制劑。

許多分子信號通路有助于維持LCSCs 的特性，Wnt/β-catenin 信號通路及其下游信號因子參與細胞增殖、存活、凋亡、侵襲、血管生成、轉移等多種細胞生理學過程[8-10]；Wnt 通過配體與其各自受體的相互作用介導Fzd 激活，F(xiàn)zd 是導致LRP5/6 磷酸化最明確的激活因子，磷酸化LRP5/6 可提高DVL 和AXIN之間的相互作用，導致β-catenin 同源二聚并易位到細胞核，最終啟動Wnt/β-catenin 信號通路靶基因的轉 錄，如CD44、cyclin D、c-Myc、Survivin 和fibronectin 等[11-13]。Nanog 與β-catenin 協(xié)同維持細胞多能性和自我更新，在肺癌細胞中下調Nanog 后，細胞增殖、集落形成和遷移減少[14]。鑒于Wnt/β-catenin 通路對腫瘤發(fā)生的顯著作用以及LCSCs 干性維持等方面的作用，本研究探討DMY 對LCSCs Wnt/βcatenin 信號轉導的影響。Western blot 結果表明，DMY 對體內外LCSCs 中Wnt/β-catenin 信號通路具有明顯抑制作用，同時減少其下游靶基因cyclin D和Survivin 表達，這可能在DMY 調節(jié)體內外肺癌細胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮一定作用。既往研究表明，激活的β-catenin 高度參與STAT3 在基因轉錄和翻譯水平的表達，磷酸化STAT3 進而導致β-catenin 的核轉位，針對Wnt/β-catenin 通路和/或STAT3 可能消除LCSCs 表型，從而完全治愈癌癥[15-16]。我們研究發(fā)現(xiàn)，兩種肺癌干細胞STAT3 在Tyr705 位點的磷酸化程度在DMY 的作用下表達減少，而DMY 不影響STAT3 在Ser727 位點的磷酸化水平。以上結果表明DMY 可能通過Wnt/β-catenin 信號通路干預LCSCs功能。

綜上所述，DMY 作為一種有效的LCSCs 抑制劑，可能通過抑制LCSCs Wnt/β-catenin 信號通路，從而發(fā)揮抗肺癌效應。