趙海燕，王曉非

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽(yáng) 110004）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種高度惡化的血管疾病，發(fā)病率和死亡率極高。研究［1］顯示，結(jié)締組織疾?。╟onnective tissue disease，CTD）是引起PAH的最主要因素之一。研究［2］表明，與原發(fā)性PAH相似，CTD相關(guān)性PAH也具有血管內(nèi)增生、平滑肌肥厚、中層增厚等臨床病理表現(xiàn)。提示兩者之間存在共同的發(fā)病機(jī)制及作用靶點(diǎn)。已有研究［3］報(bào)道缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是CTD相關(guān)性PAH形成的主要因素，缺氧條件下由肺血管重構(gòu)引起的肺動(dòng)脈高壓則是右心室衰竭和死亡的主要原因［4］。因此，改善血管生成對(duì)于PAH及CTD的治療及預(yù)后具有重要的意義。CTD相關(guān)性PAH的病情復(fù)雜，且預(yù)后極差，目前臨床上還沒(méi)有具體的治療方案來(lái)改善和穩(wěn)定病情。因此，對(duì)CTD相關(guān)性PAH機(jī)制研究尤為重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種高度保守的、長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，在生物體生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5］。近年來(lái)研究［6-7］發(fā)現(xiàn)miRNA參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等多種病理生理過(guò)程，同時(shí)也在血管系統(tǒng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起到重要作用。作為miRNA家族成員之一，miR-181a在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成中同樣扮演著重要的角色［8-9］。然而，關(guān)于miR-181a在CTD相關(guān)性PAH中的作用與機(jī)制研究卻鮮有報(bào)道。本研究探討miR-181a-5p在缺氧誘導(dǎo)的CTD相關(guān)性PAH中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

野百合堿（monocrotaline，MCT；上海阿拉丁生化科技有限公司），胰酶、EDTA、DMSO（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）一抗、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP-2）一 抗、MMP-9一 抗、β-actin一抗、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定盒（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司），MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)BIOTEK公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠40只，4～6周齡，體質(zhì)量180～220 g，由遼長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供。飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗，溫度恒定（22±1）℃，濕度恒定（45～55）%環(huán)境中，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)食，自由飲水。SD大鼠于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，此期間無(wú)精神不正常現(xiàn)象，無(wú)攝食不正?，F(xiàn)象，無(wú)其他疾病發(fā)生。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PAH大鼠模型的建立：選取健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、LV-NC組與LV-miR-181a-5p組，每組10只。模型組、LV-NC組與LV-miR-181a-5p組大鼠皮下注射MCT（60 mg/kg），建立PAH模型；LV-miR-181a-5p組大鼠分別于建模前48 h、建模后第7 天和第14 天滴鼻給予LV-miR-181a-5p（2×108TU，美國(guó)Addgene公司）干預(yù)，LV-NC組大鼠使用相同劑量LV-NC（美國(guó)Addgene公司）滴鼻作為對(duì)照，對(duì)照組注射等量生理鹽水。模型建立21 d后，同步處死各組大鼠，收集肺組織，于4 %中性多聚甲醛固定，待用于后續(xù)HE染色檢測(cè)。

1.3.2 大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)：取大鼠新鮮肺動(dòng)脈組織，漂洗、縱向剖開(kāi)并剪碎至1.5 mm×1.5 mm大小，以?xún)?nèi)膜面貼于無(wú)菌培養(yǎng)皿，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，待組織微干貼于皿底，加入4 mL完全培養(yǎng)基，于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h，然后移去培養(yǎng)皿內(nèi)動(dòng)脈組織。原代大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞使用含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將分離得到的原代大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、LV-NC組與LV-miR-181a-5p組。其中，模型組、LV-NC組與LV-miR-181a-5p組細(xì)胞于5 % O2條件下培養(yǎng)24 h，建立PAH細(xì)胞模型；LV-miR-181a-5p組細(xì)胞使用LV-miR-181a-5p感染進(jìn)行干預(yù)，LV-NC組細(xì)胞同步感染LV-NC作為對(duì)照。

1.3.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)：提取原代大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用miR-181a-5p特異性引物和染料分子SYBR Green進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-181a-5p正向引物序列為CGG GCAACATTCAACGCTGT，反向引物序列為GTGCA GGGTCCGAGGTATTC。PCR反應(yīng)條件為94 ℃反應(yīng)5 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線，60～94 ℃進(jìn)行測(cè)定分析，利用2-△△Ct方法分析PCR結(jié)果。

1.3.4 肺組織HE染色：取大鼠肺組織，經(jīng)4 %中性多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚5 μm，進(jìn)行HE染色，乙醇梯度脫水及二甲苯透明后顯微鏡（×200）下觀察。

1.3.5 Western blotting 檢測(cè)：提取原代大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白，BCA法分析定量蛋白含量，采用11 %、15 %分離膠，5 %濃縮膠進(jìn)行電泳，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5 %脫脂奶粉封閉，一抗VEGF（1∶500）、MMP-2（1∶500）、MMP-9（1∶500）、β-actin（1∶1 000）孵育，4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌后用辣根過(guò)氧化物（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶5 000）于37 ℃孵育45 min，ECL法檢測(cè)。用凝膠圖象處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.3.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期原代大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)慢病毒感染與缺氧誘導(dǎo)后，加入MTT工作液（0.5 mg/mL）置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5 % CO2）中培養(yǎng)4.5 h，4.5 h后吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，避光靜置10 min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處吸光度（optical density，OD）值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察

與對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠肺動(dòng)脈組織中膜明顯增厚，有顯著的肺血管生成現(xiàn)象，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脫落。與模型組大鼠比較，LV-miR-181a-5p組大鼠肺動(dòng)脈組織中膜增厚、肺血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脫落現(xiàn)象均得到顯著改善；LV-NC組大鼠肺動(dòng)脈組織中膜增厚、肺血管生成以及內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脫落現(xiàn)象無(wú)顯著差異。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)比較 ×200Fig.1 Pulmonary morphologic changes in each group ×200

2.2 各組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞miR-181a-5p的表達(dá)

實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、LV-NC組和LV-miR-181a-5p組細(xì)胞miR-181a-5p表達(dá)分別為1.00±0.03、0.31±0.03、0.29±0.02和1.34±0.04。與對(duì)照組細(xì)胞比較，模型組細(xì)胞miR-181a-5p的表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05）。與模型組細(xì)胞比較，LVmiR-181a-5p組細(xì)胞miR-181a-5p的表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.05）；LV-NC組細(xì)胞miR-181a-5p的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。

2.3 各組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、MMP-2與MMP-9蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組VEGF、MMP-2與MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著增高（P＜ 0.05）。與模型組比較，LV-miR-181a-5p組VEGF、MMP-2與MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05）；LV-NC組 細(xì) 胞VEGF、MMP-2與MMP-9蛋白的表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖2、表1。

2.4 各組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

圖2 各組細(xì)胞中VEGF、MMP-2與MMP-9蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expression of VEGF，MMP-2，and MMP-9 in each group

MTT結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、LV-NC組和LV-miR-181a-5p組細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果分別為0.581±0.080、0.997±0.102、0.931±0.079和0.603±0.085。與對(duì)照組比較，模型組增殖能力顯著升高（P＜ 0.05）。與模型組比較，LV-miR-181a-5p組細(xì)胞的增殖能力顯著下降（P＜ 0.05）；LV-NC組細(xì)胞的增殖能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。

表1 各組細(xì)胞中VEGF、MMP-2與MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量（n=3）Tab.1 Relative expression of VEGF，MMP-2，and MMP-9 in each group（n=3）

3 討論

CTD是一類(lèi)自身免疫疾病，其發(fā)生往往伴隨著PAH的產(chǎn)生。研究［10-11］表明，PAH是CTD患者最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，預(yù)后極差。研究［12］顯示，在CTD早期患者發(fā)現(xiàn)并治療PAH能夠有效改善患者的預(yù)后。

PAH是一類(lèi)心血管系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為血管收縮、血管重構(gòu)和血管阻力增加［13］。由細(xì)胞過(guò)度增殖引起的血管重構(gòu)是其最主要的臨床病理特征，也是導(dǎo)致其惡化的最重要原因。因此，延緩肺血管重構(gòu)進(jìn)程是提高患者預(yù)后和生存的重要手段。

VEGF是一種強(qiáng)效促血管生成因子，是血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)的關(guān)鍵介質(zhì)，它通過(guò)多樣化和復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在各種疾病中發(fā)揮作用［14-15］。有研究［16-17］表明，VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有特異性作用，并具有多種影響，包括介導(dǎo)血管新生、血管通透性、血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)等。本研究結(jié)果顯示，在缺氧誘導(dǎo)的PAH中，VEGF呈高表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力顯著升高，當(dāng)VEGF的表達(dá)受到抑制后，內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力顯著降低，缺氧誘導(dǎo)的PAH得到了改善，表明VEGF所引起的內(nèi)皮細(xì)胞血管生成在CTD相關(guān)性PAH中起到了重要的調(diào)控作用，與以往研究［18］結(jié)果一致。

MMP是一種鋅依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶，在胚胎發(fā)育、神經(jīng)過(guò)程、傷口愈合、血管生成、關(guān)節(jié)炎、心血管疾病和癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19］。MMP還可以通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的組織重塑和滲透參血管生成。MMP-2和MMP-9是肺發(fā)育過(guò)程中主要的明膠酶，對(duì)基底膜組分的降解效果優(yōu)于其他MMP［20］。MMP-2和MMP-9通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖參與血管生成過(guò)程。有研究［21］報(bào)道，缺氧可以激活與腫瘤侵襲相關(guān)的蛋白酶MMP-2和MMP-9，也會(huì)引起血管異常，促進(jìn)PAH的形成。本研究結(jié)果顯示，與正常肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞比較，經(jīng)過(guò)缺氧誘導(dǎo)后，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著上升，內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力與血管生成能力顯著升高，表明CTD相關(guān)性PAH與MMP-2和MMP-9引起的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成密切相關(guān)；而當(dāng)MMP-2和MMP-9的表達(dá)受到抑制后，內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力與血管生成能力顯著降低，缺氧誘導(dǎo)的PAH得到了一定的改善，與以往研究［22］結(jié)果一致。

miRNA是一類(lèi)在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼小分子 RNA，在細(xì)胞分化、增殖與凋亡等進(jìn)程中具有重要的調(diào)控作用。研究表明，作為miRNA家族中的成員，miR-181a-5p在內(nèi)皮細(xì)胞增殖與血管生成過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。LI等［23］發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p在乳腺癌和結(jié)腸癌疾病中，能夠抑制細(xì)胞的增殖和血管生成進(jìn)程，進(jìn)而對(duì)乳腺癌和結(jié)腸癌疾病起到一定的干預(yù)作用。有研究［24］發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p能夠降低細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)而對(duì)膠質(zhì)瘤及肺癌等疾病的發(fā)生與發(fā)展起抑制作用。本研究結(jié)果顯示，在缺氧誘導(dǎo)的PAH中，miR-181a-5p的表達(dá)水平顯著降低，當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-181a-5p后，缺氧誘導(dǎo)的PAH得到了明顯的改善，這種改善作用與VEGF、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平的降低及內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力和增殖能力的降低聯(lián)系密切，與有關(guān)miR-181a-5p作用與機(jī)制的研究報(bào)道［25］一致。

綜上所述，miR-181a-5p能通過(guò)負(fù)調(diào)控VEGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá)來(lái)影響缺氧PAH內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成，進(jìn)而對(duì)缺氧引起的CTD相關(guān)性PAH起到改善作用。本實(shí)驗(yàn)為尋找缺氧誘導(dǎo)的CTD相關(guān)性PAH的新治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。