張華，郭澍，佟爽，陳義慶，崔夢瑩，趙崇如

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院整形外科，沈陽 110001）

脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）存在于人體脂肪組織內，取材容易，且其具有較強的增殖能力及分化能力，通過旁分泌途徑發(fā)揮生物學作用，已經(jīng)用于多種動物模型治療中［1-2］。19世紀80年代外泌體（外泌體）首次提出，它是由細胞內部的囊泡釋放到胞外環(huán)境，形成具有脂質雙層結構的膜源性小囊泡，內含不同種類的蛋白質、脂質、信號因子等具有生物學活性的物質，通過將囊泡內的生物學活性物質轉移至靶細胞，參與體內多種生物學活動及疾病的發(fā)生［3-4］。本研究將傳統(tǒng)的ExoQuick試劑盒提取方法進行改良，提取ADSCs來源外泌體，與超速離心法、ExoQuick試劑盒法比較，以獲得高純度、無丟失的外泌體樣本。有研究［5］報道外泌體具有與來源細胞相同的信號分子等生物學物質，在細胞間進行信息傳遞，因此本研究將3種方法提取的外泌體加入傳統(tǒng)的ADSCs成骨誘導過程中，觀察其能否提高ADSCs的成骨效率，以驗證提取的外泌體具有生物學活性并攜帶與ADSCs相同的生物學物質。

1 材料與方法

1.1 標本來源及ADSCs的分離培養(yǎng)

ADSCs來源于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院整形外科行吸脂術的19歲健康女性患者皮下脂肪組織（經(jīng)中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，征得患者知情同意），無菌條件下強力清洗消化中和反應，1 200 r/min 25 ℃離心5 min，洗去殘留的紅細胞及油脂。加入含15%FBS和1%青-鏈霉素的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基重懸細胞，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶。放入孵箱內培養(yǎng)，換液后用倒置相差顯微鏡觀察，待ADSCs融合約80%時傳代備用。

1.2 ADSCs多向分化

取P3 ADSCs接種于6孔板中，用成骨誘導培養(yǎng)基誘導20 d后加入多聚甲醛固定，茜素紅染色，倒置相差顯微鏡下觀察鈣化結節(jié)行成情況。取第3代ADSCs接種于15 mL離心管中，用成軟骨誘導培養(yǎng)基誘導28 d后加入多聚甲醛固定，Alican染色，光學顯微鏡下觀察軟骨塊形成情況。

1.3 超速離心法、ExoQuick試劑盒法及ExoQuick試劑盒改良法提取ADSCs來源外泌體

1.3.1 超速離心法：取P3 ADSCs無血清培養(yǎng)72 h后，收集上清，4 ℃條件下，2 000g離心30 min收集上清，20 000g離心60 min收集上清，100 000g離心60 min，收集超離管底部沉淀至1管中，PBS稀釋，100 000g離心60 min，最后將收集的沉淀以100 μL PBS重懸，分裝，-80 ℃保存，收集的外泌體設為標本A。

1.3.2 ExoQuick試劑盒法：取P3 ADSCs無血清培養(yǎng)72 h后，收集上清，4 ℃條件下，3 000 g離心15 min，取上清液，按照試劑說明書，加入沉淀劑放置過夜，1 500g離心8 min，棄上清，沉淀以100 μL PBS重懸，分裝，-80 ℃保存，收集的外泌體設為標本B。

1.3.3 ExoQuick試劑盒改良法：取P3 ADSCs無血清培養(yǎng)72 h后，收集上清，4 ℃條件下，3 000g離心30 min取上清液，20 000g離心60 min，取上清液，按照試劑說明書，加入沉淀劑放置過夜，1 500g離心8 min，棄上清，沉淀以100 μL PBS重懸，分裝，-80 ℃保存，收集的外泌體設為標本C。

1.4 ADSCs來源外泌體的形態(tài)學及免疫表型鑒定

1.4.1 透射電鏡觀察形態(tài)：將各組提取的外泌體懸液（1 μL）載樣于銅網(wǎng)表面，38 ℃干燥箱靜置30 min，滴加磷鎢酸（20 g/L）室溫復染3 min，濾紙從側面吸干復染液，蒸餾水洗滌銅網(wǎng)5次，晾干，透射電鏡觀察照相。

1.4.2 Western blotting檢測蛋白表達水平：將ADSCs與處理后的3組外泌體加入裂解液冰上靜置20 min，渦旋，冰上靜置10 min，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，吸取上清液至EP管中，根據(jù)BCA試劑盒說明書進行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液，100 ℃金屬浴10 min使蛋白變性。并根據(jù)定量結果分別上樣，電泳結束后，按照Marker指示的分子質量截膠，轉膜，清洗封閉，分別孵CD63抗體（1∶500稀釋）、CD9抗體（1∶250稀釋）4 ℃過夜，洗膜后分別孵二抗（1∶2 000稀釋）1 h，洗膜后加入顯色劑觀察。

1.5 外泌體加入ADSCs成骨分化誘導并行功能學檢測

1.5.1 分組處理：取P3 ADSCs融合至80%左右時，分別將3種提取方法提取的外泌體，以200 ng/μL的質量濃度分別加入成骨誘導培養(yǎng)基中，對ADSCs進行成骨分化誘導。具體分為：A組，加入標本A 外泌體成骨誘導液的ADSCs；B組，加入標本B 外泌體成骨誘導液的ADSCs；C組，加入標本C 外泌體成骨誘導液的ADSCs；空白對照組（D組）：加入無外泌體的普通成骨誘導液的ADSCs。誘導20 d后進行茜素紅染色，倒置相差顯微鏡下觀察各組鈣化結節(jié)形成情況。

1.5.2 Western blotting檢測蛋白表達水平：將4組ADSCs加入裂解液，置于冰上裂解30 min，用細胞刮刀刮凈培養(yǎng)瓶底部的細胞裂解物，并收集至EP管中，渦旋，冰上靜置10 min，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，吸取上清液至EP管中，根據(jù)BCA試劑盒說明書進行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液，100 ℃金屬浴10 min使蛋白變性。并根據(jù)定量結果分別上樣，電泳結束后，按照Marker指示的分子質量截膠，轉膜，清洗封閉。分別孵育Runx2抗體、OCN抗體反應過夜，二抗孵育1 h，洗膜后加入顯色劑觀察。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，各組數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ADSCs形態(tài)學觀察及多向分化

圖1 ADSCs形態(tài)特點及多向分化鑒定 ×100Fig.1 Morphology and multidirectional differentiation of ADSCs ×100

ADSCs接種后5 d，鏡下觀察可見ADSCs長滿培養(yǎng)瓶底部，生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)均一，呈集落樣生長，方向性明顯（圖1A）。ADSCs經(jīng)成骨誘導，胞體逐漸變大，由長梭形變成多角形，20 d茜素紅染色鏡下觀察可見鈣結節(jié)被染成紅色（圖1B）。ADSCs經(jīng)成軟骨誘導，在管底可見乳白色球形細胞團塊，28 d Alican染色鏡下觀察可見胞質及細胞外基質分泌的硫酸黏蛋白被染色藍色（圖1C）。

2.2 ADSCs來源外泌體的形態(tài)學及免疫表型鑒定

2.2.1 外泌體形態(tài)學觀察結果：結果顯示，標本A、B、C 外泌體在透射電鏡下均可見明顯異質性圓形或類圓形小囊泡，直徑40～130 nm，有完整膜，內有低電子密度小顆粒。標本A 外泌體含量較標本B、C少，且囊泡大小不均一；標本B、C 外泌體含量較多，且囊泡大小較均一，但經(jīng)多次實驗標本B均顯示背景污染嚴重，分析可能存在其他蛋白質污染（圖2）。

圖2 ADSCs來源exosomes的形態(tài)學鑒定 ×60 000Fig.2 Morphology of exosomes ×60 000

2.2.2 Western blotting檢測蛋白表達水平：與對照組比較，3組標本都有CD9、CD63蛋白表達。與A組比較，B組CD9、CD63蛋白表達顯著增多（P＜ 0.01）；與B組比較，C組CD9、CD63蛋白表達顯著增多（P＜0.01），見圖3。

2.3 外泌體與ADSCs共培養(yǎng)后成骨分化誘導及其功能學檢測

2.3.1 成骨分化誘導：結果顯示，4組經(jīng)鏡下觀察均可見胞體逐漸變大，由長梭形變成多角形，20 d茜素紅染色鏡下觀察可見鈣結節(jié)被染成紅色。C組較其他3組鏡下紅色鈣結節(jié)密度更大，見圖4。

2.3.2 Western blotting檢測蛋白表達水平：結果顯示，4組都有Runx2、OCN蛋白表達。與D組比較，A、B、C組Runx2、OCN蛋白表達顯著增多（P＜ 0.01）；且B組較A組Runx2、OCN蛋白表達更多（P＜ 0.01），C組較B組Runx2、OCN蛋白表達更多（P＜ 0.01），見圖5。

3 討論

圖3 Western blotting檢測各組CD9、CD63蛋白表達Fig.3 CD9 and CD63 protein expressions determined by by Western blotting

圖4 各組成骨分化誘導結果 ×100Fig.4 Induction of osteogenic differentiation in each group ×100

圖5 成骨誘導20 d后各組Runx2、OCN蛋白表達Fig.5 Expressions of Runx2 and OCN proteins in each group induced after 20 days

ADSCs來源便捷、易增殖，具有向成骨細胞、成軟骨細胞、成纖維細胞等多向分化潛能。它可通過旁分泌分泌各種細胞因子（IGF、TGF 和 VEGF、肝細胞生長因子等），能夠促進多種組織與細胞的生長，發(fā)揮多種生物學作用［6-7］。相同體積的脂肪組織和骨髓組織，脂肪組織中干細胞的數(shù)量遠遠超過骨髓組織，因此，ADSCs 被廣泛用于組織修復或再生（骨/軟骨修復、心血管組織再生、椎間盤修復等［8］）。本實驗通過對ADSCs形態(tài)學觀察及成骨、成軟骨分化，證實提取的細胞為ADSCs。

幾乎所有類型的細胞都在生理或病理條件（細胞活化、應激和凋亡）下釋放外泌體。外泌體的形成是由細胞膜內陷形成胞內小泡，以出芽形式釋放到胞外環(huán)境，其內具有與來源細胞相同的信息，在細胞間進行信息傳遞［9-11］。所以獲取高純度和無蛋白丟失的外泌體樣本是進一步探尋其功能機制的基礎。外泌體的直徑多介于40～150 nm之間，凈化非常困難，目前已知的提取方法有多種，包括超速離心法、免疫親和捕獲、密度梯度離心法、ExoQuick試劑盒法等［12-13］。因超速離心法及ExoQuick試劑盒法應用較多，儀器試劑較易準備，所以本次研究采用超速離心法和ExoQuick試劑盒法提取ADSCs來源外泌體，且嘗試在ExoQuick試劑盒法前加一步超度離心作為ExoQuick試劑盒改良法，以探究更高效的ADSCs中外泌體的提取方法。

本研究結果顯示，根據(jù)透射電鏡觀察，可見標本A 外泌體大小不一，分布較稀疏。標本B 外泌體大小較均一，密度也較標本A多，但經(jīng)過多次提取觀察背景污染均比較嚴重，可能因ExoQuick試劑盒是根據(jù)外泌體表面的脂質雙分子層結構具有一定的疏水性，用試劑捆綁水分子，通過常規(guī)離心收集沉淀獲取外泌體，雖然這種方法從細胞中獲取外泌體的方法簡單易操作，但其分離出的沉淀中會摻雜一些未知的疏水大分子物質。標本C 外泌體大小較均一，密度較標本A多，與標本B相仿，且背景清晰。根據(jù)Western blotting檢測，3種方法均表達外泌體表面特異性標志物CD9、CD63蛋白，但標本A的蛋白表達量較低，標本B、C蛋白表達量較高，且標本C的蛋白表達量較標本B高。證實ExoQuick試劑盒改良法以離心去除部分大分子蛋白質后，提高了外泌體的提取效率，為ADSCs來源外泌體的最優(yōu)提取方法。

外泌體內含有不同種類的蛋白質、脂質、mRNAs、microRNAs、信號分子等與其來源細胞相同的生物學活性物質，較易通過膜融合，將生物學活性物質選擇性地傳遞至鄰近細胞，發(fā)揮多種生物學功能［14］。為了驗證3種方法提取的外泌體是否具有生物學活性，發(fā)揮信息傳遞作用，選擇ADSCs成骨分化方向，分別在成骨誘導液中加入3種方法提取的外泌體，對ADSCs進行成骨誘導，ADSCs誘導一段時間后進行鏡下觀察和Western blotting檢測。結果顯示，外泌體的成骨誘導液誘導的ADSCs較普通成骨誘導液誘導的ADSCs，鏡下觀察到更多的紅色鈣結節(jié)；經(jīng)Western blotting檢測，加入外泌體的成骨誘導液誘導的ADSCs較普通成骨誘導液誘導的ADSCs Runx2和OCN表達量也有所提高。且加入ExoQuick試劑盒改良法提取的外泌體的成骨誘導過程，鏡下觀察到的紅色鈣結節(jié)最為密集；Western blotting顯示Runx2和OCN表達量最多。進一步證實了外泌體確實具備進入細胞的活性、促進ADSCs成骨分化，且ExoQuick試劑盒改良法提取的ADSCs來源外泌體純度高，誘導效果最好。

綜上所述，改良的ExoQuick試劑盒法與超速離心法、ExoQuick試劑盒法均能獲得外泌體，且Exo-Quick試劑盒改良法為提取ADSCs來源外泌體的最優(yōu)方法。經(jīng)ADSCs成骨分化誘導實驗，驗證提取的外泌體均具備進入ADSCs的活性，攜帶與ADSCs相同的促進ADSCs的成骨分化生物學物質，且ExoQuick試劑盒改良法提取的外泌體誘導效果最好，本研究為進一步探究ADSCs來源外泌體信息傳遞機制及臨床應用奠定了基礎。