宋柏璇，于麗，趙振坤，趙志國，王秋旭

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院口腔頜面外科，沈陽 110004；2.遼陽市中心醫(yī)院口腔科，遼寧 遼陽 111009；3.杭州口腔醫(yī)院特診科，杭州 310012；4.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽 110004）

淋巴管畸形是由淋巴管擴張形成的大小不等的囊腔，其病理性質(zhì)歷來是眾多學(xué)者的關(guān)注熱點，其中以畸形和腫瘤學(xué)說最具有代表性［1］。前者認為淋巴管畸形是一種發(fā)育畸形，由淋巴管先天性發(fā)育異?；蛄馨凸芎筇焓芡饨绱碳U張而成；后者認為淋巴管畸形是一種良性腫瘤，由淋巴管內(nèi)皮細胞異常增殖而成。研究［2］發(fā)現(xiàn)，淋巴管畸形的淋巴管內(nèi)皮細胞具有高度增殖潛力，注射到小鼠體內(nèi)時可形成淋巴管畸形樣病變。在國際脈管性疾病研究學(xué)會分類中，淋巴管畸形未被認為是腫瘤［3］。研究發(fā)現(xiàn)［4-8］，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路及血管內(nèi)皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）參 與腫瘤淋巴管生成。本研究通過應(yīng)用免疫組化SP法檢測淋巴管畸形組織及正常淋巴組織標本中PI3K和VEGF-C的表達情況，探討PI3K和VEGF-C在口腔頜面部淋巴管畸形中的表達。

1 材料與方法

1.1 標本來源

淋巴管畸形組織來源于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院2009年至2014年間手術(shù)治療的淋巴管畸形患者，共35例，其中以頰部、腮腺、頜頸部多見，占總量的85.71%，均經(jīng)病理證實為淋巴管畸形。正常淋巴組織從腮腺及頜下腺病變組織中分離而來，共10例，經(jīng)HE染色后確定為正常淋巴組織。

1.2 方法

兔抗人VEGF-C抗體、兔抗人PI3K p110α抗體，購自武漢博士德有限公司。

將35例淋巴管畸形組織和10例正常淋巴組織于切片機上做4 μm的連續(xù)切片。切片用二甲苯脫蠟2次，依次置于95%、80%、70%乙醇中脫苯。采用高壓修復(fù)抗原。用3%過氧化氫浸泡，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。加入一抗（兔抗人VEGF-C抗體、兔抗人PI3K p110α抗體）和通用型二抗，在37 ℃水浴箱中孵育，每次孵育后PBS沖洗。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，鏡檢。分別用PBS代替2種一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

免疫組化以細胞質(zhì)和細胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。按照陽性細胞所占比例分別記1～4分：1分，＜25%；2分，25%～＜50%；3分，50%～＜75%；4分，≥75%。按染色強度分別記0～3分：0分，陰性，不著色；1分，弱陽性，淺棕色；2分，陽性，棕黃色；3分，強陽性，棕褐色。二者相乘，0～1分為陰性，2～12分為陽性。染色結(jié)果由2名高年資病理醫(yī)生獨立進行判定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進行分析。PI3K、VEGF-C在淋巴管畸形和正常淋巴組織中陽性表達率的比較采用χ2檢驗；PI3K、VEGF-C在淋巴管畸形中的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化結(jié)果表明，PI3K、VEGF-C位于細胞質(zhì)及細胞膜中，在淋巴管畸形組織中高度表達（圖1）。

圖1 淋巴管畸形組織中PI3K和VEGF-C陽性表達 ×200Fig.1 Positive expression of PI3K and VEGF-C in lymphatic malformations ×200

淋巴管畸形組織中，PI3K的陽性表達率為80.00%（28/35），VEGF-C的陽性表達率為88.57%（31/35）；正常淋巴組織中，PI3K和VEGF-C的陽性表達率均為0%（0/10）。淋巴管畸形組織中PI3K、VEGF-C的陽性表達率明顯高于正常淋巴組織（χ2=17.910，P＜ 0.05；χ2=24.487，P＜ 0.05）。

淋巴管畸形組織，PI3K與VEGF-C的陽性表達呈正相關(guān)（r=0.495，P＜ 0.05）。

3 討論

PI3K是一種異二聚體，由PIK3CA基因編碼的p110α催化亞基和PI3KR1編碼的調(diào)節(jié)亞基（p85）組成［7］。PI3K介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一，調(diào)控多種細胞活動。PI3K/AKT信號通路是近年來研究的熱點通路，在人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。研究［6，8-11］還發(fā)現(xiàn)，該通路參與腫瘤血管及腫瘤淋巴管生成，促進腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。VEGF-C是VEGF家族的重要成員，是重要的淋巴管生成因子之一，在腫瘤組織中高度表達。許多臨床研究［12］顯示，VEGF-C表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。VEGF-C可與淋巴管內(nèi)皮細胞上表達的酪氨酸激酶受體VEGFR-3結(jié)合，促進淋巴管的增殖，從而誘導(dǎo)腫瘤淋巴管的生成和淋巴轉(zhuǎn)移［7］。

目前關(guān)于VEGF-C與腫瘤淋巴管生成及轉(zhuǎn)移的研究較多，而關(guān)于PI3K/AKT與腫瘤淋巴管生成及轉(zhuǎn)移的研究較少。近年來研究［11，13］發(fā)現(xiàn)，PI3K介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路可被上游分子激活，通過作用下游底物分子促進VEGF-C的表達及分泌。研究［11］發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白的額外結(jié)構(gòu)域A可能通過PI3K/AKT信號通路上調(diào)結(jié)直腸癌中VEGF-C的表達，從而誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成。在單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎淋巴管生成中，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞通過C-C基序趨化因子受體2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR2）激活PI3KAKT-mTOR信號傳導(dǎo)以介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達，然后驅(qū)動VEGF-C表達以促進淋巴管生成［13］。然而現(xiàn)階段人們對 PI3K介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路及VEGF-C如何促進腫瘤淋巴管生成及淋巴轉(zhuǎn)移仍存在許多未知，并且兩者之間的具體作用機制仍不清楚，期待對該通路進行深入的研究。

本研究從分子水平檢測淋巴管畸形和正常淋巴組織中PI3K、VEGF-C表達情況，發(fā)現(xiàn)在淋巴管畸形組織及正常淋巴組織中PI3K、VEGF-C陽性表達存在顯著差異，提示PI3K、VEGF-C與淋巴管畸形內(nèi)皮細胞增殖有關(guān)。淋巴管畸形組織中，PI3K、VEGF-C陽性表達存在相關(guān)性，提示在淋巴管畸形中PI3K 介導(dǎo)PI3K/AKT 信號通路被上游分子激活，通過下游分子作用促進 VEGF-C 表達及分泌，共同參與淋巴管畸形的發(fā)生及發(fā)展。本研究表明，PI3K和VEGF-C的異常表達可能與淋巴管畸形的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為淋巴管畸形病因?qū)W研究的指標之一。

迄今為止，淋巴管畸形的發(fā)病機制及病理性質(zhì)尚不明確。臨床上可表現(xiàn)為一個孤立的病灶或彌漫性病灶，或作為混合血管病灶的一部分，或作為各種過度生長綜合征重要的并發(fā)癥，常伴有外觀及功能的改變。手術(shù)及硬化劑治療可以改善患者的局部癥狀和外觀，但完全緩解較為罕見［14］。目前對淋巴管畸形病因?qū)W的研究仍很膚淺，所以，該領(lǐng)域仍存在大量的未知問題有待進一步深入研究和解決。通過對淋巴管畸形發(fā)病機制的研究，尋找更好的治療方法，進而改善患者預(yù)后。