張靜靜，邢佳鑫，吳雪，許鳳玲，宣金鋒，姚軍，王保捷

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證學(xué)教研室，沈陽 110122；2.附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001）

精神分裂癥作為一種大腦神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙性疾病，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。全世界大約有1%的人患有精神分裂癥，研究［1-2］表明這一比例還在持續(xù)增高，而其中偏執(zhí)型發(fā)病率最高。有關(guān)精神分裂癥發(fā)病機(jī)制的研究至今仍在進(jìn)行，最新的研究［3］表明，遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致了疾病的發(fā)生，其中遺傳因素為主導(dǎo)。多巴胺受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體，根據(jù)其生理及藥理學(xué)特性，目前發(fā)現(xiàn)的5種受體被分為2個亞群，多巴胺受體D5（dopamine receptor D5，DRD5）屬于D1亞群，包括藥物成癮以及精神分裂癥等許多精神疾病的治療藥物都將其作為靶點(diǎn)。在大腦的邊緣系統(tǒng)、下丘腦、額葉的皮質(zhì)以及紋狀體等重要部位的神經(jīng)元中，DRD5是發(fā)揮信息傳遞作用、傳遞神經(jīng)沖動的重要功能性物質(zhì)［4-6］，發(fā)生位點(diǎn)突變可能會造成DRD5表達(dá)量的變化，繼而影響與多巴胺的結(jié)合能力，從而導(dǎo)致磨牙癥、偏執(zhí)型精神分裂癥以及藥物成癮等精神性疾病的發(fā)生［7-9］。本課題組在對DRD5基因的前期研究中，在分子水平上探索了4個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與偏執(zhí)型精神分裂癥發(fā)病的相關(guān)性［1］，最終證實(shí)了一些核苷酸位點(diǎn)的突變與精神分裂癥的發(fā)生存在一定的聯(lián)系。為了進(jìn)一步探索在精神分裂癥發(fā)病機(jī)制中DRD5基因發(fā)揮的作用，本研究以包含DRD5基因的rs77434921和rs2076907位點(diǎn)的5’端核苷酸序列為基礎(chǔ)，分析不同單倍型是否可以影響DRD5基因的表達(dá)；以及5’端的不同片段在DRD5基因表達(dá)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞和人胚腎（human embryo kidney，HEK）293細(xì)胞購于中國科學(xué)院；JM109化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購于中國Trans公司；pGL3螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體與雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒均購于美國Promega公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BglⅡ及T4 DNA連接酶均購于美國Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均購于美國Axygen公司；Lipofectamine?3000購于美國Invitrogen公司；Prime STAR HS DNA聚合酶、序列特異性引物、250 bp DNA Ladder和PrimScript?RT Reagent試劑盒均購于日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)增目的片段：根據(jù)pGL3載體存在的酶切識別位點(diǎn)，在引物5’端添加限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BglⅡ的識別序列。以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為基準(zhǔn)，rs77434921位于-1 095位置處，而rs2076907位于+171位置處。

P1～P4載體分別包含4種單倍型G-G、G-C、A-G、A-C，均采用正義序列F1：5’-GGGGTACCCCT TCGGAGTAGTGAAAGGAGAAGAAGCA-3’ 和反義序 列R1：5’-GAAGATCTTCCAGCAGGGTCCAGATG ATGAGTAGG-3’擴(kuò)增，產(chǎn)物長度均為2 163 bp。P5和P6載體僅含rs77434921位點(diǎn)G和A，采用正義序列F1和反義序列R2：5’-GAAGATCTTCGTGTCTGGTT CGGAGCGAGAGAAG-3’擴(kuò)增，產(chǎn)物長度均為1 681 bp。P7和P8載體僅含rs2076907位點(diǎn)G和C，采用正義序列F2：5’-GGGGTACCCCGCCGAAACACTTCAC AAATGCAACT-3’和反義序列R1擴(kuò)增，產(chǎn)物長度均為1 498 bp。P9、P10、P11和P12為DRD5基因5’截短后的載體，分別采用正義序列F9：5’-GGGGTACCCC AACACACTGACGGTGTTTCATCAGG-3’、F10：5’-GGGGTACCCCCAAACAGGATGGAGGAGGCAC AAT-3’、F11：5’-GGGGTACCCCATGGTCTTGCCCT CTCCAGCG-3’、F12：5’-GGGGTACCCCATGGTCTT GCCCTCTCCAGCG-3’和對應(yīng)公共下游引物反義序列R1進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物長度分別為2 030、1 908、1 777和1 620 bp。見圖1。

圖1 擴(kuò)增產(chǎn)物長度及位置Fig.1 PCR product length and the location of primers

PCR反應(yīng)總體系50 μL，2×Prime STAR GC Buffer（含Mg2+）25 μL，dNTP 4 μL，濃度為15 pmol/L的引物各3 μL，Prime STAR HS DNA聚合酶1 U，模板DNA 0.1 μg。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，64.2℃ 5 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.2.2 純化目的片段：在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行PCR產(chǎn)物的電泳，使用試劑盒回收DNA，并測濃度。將純化的目的片段進(jìn)行平末端的加A反應(yīng)，總體系20 μL，DNA片 段15 μL，5×Tailing-A Reaction Buffer 4 μL，Tag DNA聚合酶1 μL，72 ℃反應(yīng)30 min。T-A連接反應(yīng)總體系為10 μL，10×T4 DNA Ligation 緩沖液1 μL，T4 連接酶1 μL，T-載體50 ng，目的片段400 ng，16 ℃反應(yīng)8～12 h。

1.2.3 構(gòu)建載體：將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)物測序驗(yàn)證后，采用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BglⅡ構(gòu)建PGL3熒光素酶載體。PGM-T酶切反應(yīng)體系10 μL，PGM-T載體7 μL，10×Buffer、KpnⅠ和BglⅡ各1 μL，37 ℃酶切30 min后，80 ℃滅活5 min。PGL3載體酶切反應(yīng)體系10 μL，滅菌去離子水6 μL，30 ng/μL的PGL3-Basic載體、10×Buffer、KpnⅠ和BglⅡ各1 μL，37 ℃酶切30 min后，80 ℃滅活5 min。連接反應(yīng)體系10 μL，DNA片段90～240 ng，30 ng/μL的PGL3載 體、10×T4 DNA Ligation Buffer和T4 DNA Ligation各1 μL，16 ℃反 應(yīng)8～12 h。

1.2.4 熒光素檢測：通過HEK293和SK-N-SH兩種細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，使用管式化學(xué)發(fā)光檢測儀（Berthold LB 9508，德國Berthold公司）檢測螢火蟲熒光素酶活性，每組樣品一式3份，每份重復(fù)3次。

1.2.5 提取RNA及分析：將P6及P4載體分別與TK載體一起轉(zhuǎn)染，用Trizol法提取樣品RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后用實(shí)時定量PCR法對重組載體與TK載體在cDNA水平進(jìn)行相對的定量分析，觀察RNA表達(dá)變化。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL，5×PrimeScript 緩沖液4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 4 μL，RNA 500 ng。

PGL3引物，正義序列：5’-ACGGATTACCAGG GATTTCA-3’，反義序列：5’-AGCGACACCTTTAGGC AGAC-3’；Tk引物，正義序列：5’-GCTTGGAGCGAA CGACC-3’，反義序列：5’-CGAAACCCGACAGGACT A-3’。使用日本TaKaRa公司Prime Script?RT Reagent試劑盒，反應(yīng)條件參照試劑盒操作手冊。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對熒光素酶報(bào)告分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。相對熒光強(qiáng)度結(jié)果以表示，不同片段重組載體之間的多重比較采用LSDt檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證克隆載體

應(yīng)用DNA克隆方法結(jié)合PCR法，將目的序列擴(kuò)增并插入PGL3載體中，完成載體構(gòu)建。采用限制性內(nèi)切酶處理的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行測序，測序結(jié)果一致。

P1、P2、P3、P4重組載體酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，長片段為4 787 bp的PGL3載體片段，短片段為2 163 bp的目的片段。見圖2。

圖2 P1、P2、P3、P4重組載體酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of the enzyme-digested products of P1，P2，P3，and P4 recombinant vectors

對rs77434921和rs2076907 2個SNP分別進(jìn)行克隆，成功構(gòu)建P5、P6、P7、P8重組載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，長片段為4 787 bp的PGL3載體片段，短片段為目的片段（P5：1 700 bp，P6：1 700 bp，P7：1 518 bp，P8：1 518 bp）。見圖3。

圖3 P5、P6、P7、P8重組載體酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of the enzyme-digested products of P5，P6，P7，and P8 recombinant vectors

為了研究DRD5基因5’端區(qū)域在基因表達(dá)中的調(diào)控趨勢，對5’端的-1 599～-934這段序列進(jìn)行了多次截短，完成了P9～P12載體的構(gòu)建，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，長片段為4 787 bp的PGL3載體片段，短片段為目的片段（P9：2 050 bp，P10：1 797 bp，P11：1 928 bp，P12：1 640 bp）。見圖4。

2.2 雙熒光素酶報(bào)告分析

隨機(jī)以單倍型G-G的相對熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，在HEK293和SK-N-SH兩種不同的細(xì)胞中對4種單倍型對熒光素酶活性的影響進(jìn)行分析。與G-G相比，A-G、G-C、A-C三者熒光素酶活性的表達(dá)在2種細(xì)胞系中均未發(fā)生顯著變化（P＞ 0.05）。

圖4 P9、P10、P11、P12重組載體酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of the enzyme-digested products of P9，P10，P11，and P12 recombinant vectors

圖5 P5、P6、P7、P8以及P1、P4重組載體相對熒光強(qiáng)度分析圖Fig.5 Relative fluorescence intensity of P5，P6，P7，P8，P1，and P4 recombinant vectors in HEK293 and SK-N-SH cells

2個 SNP位點(diǎn)的不同單倍型在2種細(xì)胞中均沒有產(chǎn)生明顯的熒光強(qiáng)度改變（P＞ 0.05）。然而在對序列進(jìn)行截短后，發(fā)現(xiàn)其相對熒光強(qiáng)度顯著變化，P5載體與P1載體相比、P6載體與P4載體相比，相對熒光強(qiáng)度均顯著升高（P＜ 0.001）。P7載體與P1載體相比、P8載體與P4載體相比，相對熒光強(qiáng)度均顯著下降（P＜ 0.001）。見圖5。

在HEK293細(xì)胞中，P9載體與P4載體相比，相對熒光強(qiáng)度顯著下降，而P8載體與P12載體相比，相對熒光強(qiáng)度顯著升高（P＜ 0.001）。然而在SK-N-SH細(xì)胞中，P9載體與P4載體相比、P11載體與P10載體相比、P8載體與P12載體相比，相對熒光強(qiáng)度均有不同程度下降（P＜ 0.001）。P10載體與P9載體相比、P12載體與P11載體相比，相對熒光強(qiáng)度表現(xiàn)為不同程度升高（P＜ 0.001）。見圖6。

圖6 截短片段重組載體相對熒光強(qiáng)度分析圖Fig.6 Relative fluorescence intensity of P4，P9，P10，P11，P12，and P8 recombinant vectors in HEK293 and SK-N-SH cells

2.3 實(shí)時定量PCR進(jìn)行mRNA水平分析

+82～+171這段區(qū)域?qū)儆贒RD5基因的5’端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）。將P6載體和P4載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通提取樣品RNA，逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行定量。結(jié)果表明，與P4載體相比，P6載體的相對RNA水平顯著升高，相對熒光強(qiáng)度和相對RNA水平升高在HEK293細(xì)胞中約為3.2倍和1.6倍，而在SK-N-SH細(xì)胞中分別約為6.7倍和7倍。

3 討論

本研究在轉(zhuǎn)錄水平對DRD5基因的rs77434921和rs2076907這2個SNP對基因表達(dá)的影響進(jìn)行了探索。在本課題組的前期研究中，沒有發(fā)現(xiàn)4種單倍型的相對熒光強(qiáng)度存在顯著差異。對于這一結(jié)果，可能的原因是存在一些與編碼區(qū)的致病SNP有連鎖關(guān)系的非編碼區(qū)SNP，在一些頻率調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的非編碼區(qū)SNP與某些疾病存在關(guān)聯(lián)，根本原因是與其連鎖的編碼區(qū)SNP的致病性［10-13］。另外，不排除在發(fā)揮調(diào)控作用時，存在的多個SNP之間發(fā)生了相互作用，因此本研究將2個SNP單獨(dú)進(jìn)行了研究，然而仍然沒有發(fā)現(xiàn)單獨(dú)存在時SNP的不同單倍型對基因表達(dá)水平有明顯影響。當(dāng)然本研究結(jié)果依然存在很多局限性，如很可能因?yàn)榧?xì)胞系選擇的局限，從而未能對DRD5基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行全面分析。

本研究僅選擇了2種在精神系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究中常用的細(xì)胞系HEK293和SK-N-SH［14］。研究發(fā)現(xiàn)，與P4載體相比，P9載體相對熒光強(qiáng)度在HEK293和SK-N-SH細(xì)胞中均有不同程度降低，說明-1 599～-1 486這段序列可能存在正調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn)；在2種不同的細(xì)胞系中，-1 076～-934這段序列表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)作用，在HEK293細(xì)胞中抑制基因表達(dá)，而在SK細(xì)胞中促進(jìn)表達(dá)；此外在SK-N-SH細(xì)胞中-1 364～-1 233這段序列能夠促進(jìn)表達(dá)，而-1 233～-1 076和-1 486～-1 364序列對基因表達(dá)存在負(fù)調(diào)控?？赡苁怯捎诓煌?xì)胞之間本來就有很大的差異，SK-N-SH細(xì)胞作為一種神經(jīng)細(xì)胞，其生長速度、代謝速率都與HEK293細(xì)胞不同，表達(dá)的各自轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子也有差別，因而表現(xiàn)出的調(diào)控作用才會不同［15］。因此，在對基因的表達(dá)進(jìn)行研究時，最好可以更全面地進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以便調(diào)控機(jī)制的研究更科學(xué)、全面、準(zhǔn)確。

在對5’端序列進(jìn)行截短的研究發(fā)現(xiàn)，+82～+564這段序列對基因的表達(dá)具有很顯著的下調(diào)作用。+82～+564這段序列存在部分DRD5基因的5’端UTR，而5’端UTR的主要作用是參與RNA的翻譯以及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。結(jié)果表明，-1 599～+82這段5’端UTR部分缺失的片段，其RNA水平與相對熒光素酶活性在2種細(xì)胞系中均有不同水平的升高。這一結(jié)果表明，在DRD5基因中5’端UTR存在對RNA轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的抑制作用。有研究報(bào)道在緊接5’端UTR啟動子下游的重要的操縱元件，是阻遏蛋白識別并且結(jié)合的區(qū)域，阻遏蛋白通過抑制啟動子復(fù)合物的形成對基因表達(dá)存在負(fù)調(diào)控作用?；虮磉_(dá)的轉(zhuǎn)錄及翻譯是一個極其復(fù)雜的過程，并且由于DRD5基因本身構(gòu)成具有復(fù)雜性［10］，因而對機(jī)制的深入研究造成了困難。

本研究探討了DRD5基因5’端序列及SNP位點(diǎn)對基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，旨在為DRD5基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制的深入研究提供參考信息，為進(jìn)一步探討其與偏執(zhí)型精神分裂癥發(fā)病的關(guān)聯(lián)性提供思路。