鄭杰夫，殷林波，宋成博，傅雅靜，姜擁軍，張子寧

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，國家衛(wèi)生健康委員會艾滋病免疫學重點實驗室，遼寧省艾滋病免疫學重點實驗室，中國醫(yī)學科學院艾滋病免疫學重點實驗室，沈陽 110001）

免疫系統(tǒng)失衡是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染致病及疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因［1］。作為適應性免疫的重要組成部分，CD4+T細胞可通過分泌多種細胞因子輔助細胞及體液免疫應答，被稱為輔助性T細胞。依據(jù)分泌細胞因子的不同，CD4+T細胞分為Ⅰ型輔助性T細胞（type Ⅰ helper T cell，Th1）及Ⅱ型輔助性T細胞（typeⅡ helper T cell，Th2）2個亞群。Th1細胞主要分泌白細胞 介 素（interleukin，IL）-2、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子等，參與調(diào)節(jié)細胞免疫；Th2細胞分泌IL-4、IL-6、IL-10等，主要調(diào)節(jié)體液免疫［2］。以往研究［3］顯示，HIV感染中Ⅰ型細胞因子IFN-γ水平出現(xiàn)下降趨勢，而Ⅱ型細胞因子IL-4逐漸上升，Thl/Th2細胞平衡向Th2細胞方向漂移。由于Th1細胞有助于增強細胞毒性T細胞應答，而細胞毒性T細胞應答是最重要的抗HIV免疫應答，因此HIV感染中Th1/Th2細胞失衡與AIDS患者病情加重有關(guān)［4］，而長期不進展者則維持正常的Th1/Th2細胞平衡［5］。迄今為止，HIV感染中Th1/Th2細胞失衡的機制尚未徹底闡明，明確其機制對于HIV臨床進程的干預具有重要意義。

T細胞因子1（T cell factor 1，TCF1）是Wnt信號通路的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合β-catenin，激活下游信號［6］。TCF1表達在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腫瘤發(fā)病中具有重要作用［7-9］。YU等［10］在對小鼠T淋巴細胞進行研究時發(fā)現(xiàn)，TCF1可誘導Th2細胞早期表達，對Th1細胞起到負調(diào)控作用。但是，TCF1能否調(diào)控HIV感染中Th1/Th2細胞平衡尚無報道。鑒于Th1/Th2細胞漂移在HIV感染致病中的重要作用，本研究探討了TCF1對HIV感染者Th1/Th2細胞平衡的作用，希望為HIV感染臨床結(jié)局的免疫調(diào)控提供信息。

1 材料與方法

1.1 研究對象

11例HIV感染者均來自遼寧，男性，平均年齡為（40.73±15.60）歲（范圍：18～64歲），CD4+T細胞計數(shù)絕對值（258.91±63.77）/μL，于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療前收集血液標本。5例健康對照者為隨機選取的HIV抗體陰性的健康成人，男性，平均年齡（31.40±8.43）歲（范圍：22～46歲）。研究對象均簽署知情同意書。

1.2 siRNA轉(zhuǎn)染

使 用Ficoll?-Paque PLUS（美 國GE Healthcare公司）通過密度離心分離HIV感染者CD4+、CD8+T細胞的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），將5×105個細胞重懸至160 μL R10培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素，RPMI 1640），制成細胞懸液，接種于96孔板中。每孔加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent（美國Thermo Fisher Scientific公 司）1.2 μL、TCF1-siRNA（北京華大基因公司）0.2 μL、RPMI 1640（美國GE Healthcare公 司）38.6 μL，在37 ℃、5%CO2條 件下培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染TCF1-siRNA為si-TCF1組，未轉(zhuǎn)染TCF1-siRNA的對照組為TCF1組，Control組為si-TCF1組和TCF1組的畫門策略。

1.3 TCF1 mRNA檢測

采用RNeasy Micro試劑盒（德國QIAGEN公司）提取HIV感染者CD4+、CD8+T細胞的RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent試劑盒（日本TaKaRa公司）實時定量PCR方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA合成條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃終止。利用GAPDH作為內(nèi)參，配置cDNA實時定量體系，接種于96孔板中。實時定量體系：每孔TCF1/GAPDH-R 0.8 μL、TCF1/GAPDH-F 0.8 μL、無核酸水6.5 μL、cDNA 2 μL、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）10 μL 。實時定量PCR（瑞士Roche公司）檢測后對Ct值進行分析。實時定量PCR反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，55 ℃ 30 s（擴增40個循環(huán)），50 ℃ 30 s。TCF1引物序列：上游引物，5’-CCTTGATGCTAGGTTCTGGT GTACC-3’；下游引物，5’-CACTCTGCAATGACCTTG GCTCTCA-3’。GAPDH引物序列：上游引物，5’-AT GGGGAAGGTGAAGGTCG-3’；下游引物，5’-GGGGT CATTGATGGCAACAATA-3’。

1.4 細胞培養(yǎng)與流式細胞術(shù)

為了檢測HIV感染者及健康對照者Th1和Th2細胞因子分泌水平，將HIV感染者及健康對照者新鮮全血經(jīng)溶血素溶血后每個流式管加入3 μL Cell Activation Cocktail（美國BioLegend公司），在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，經(jīng)PBS洗滌離心后進行表面染色與細胞破膜實驗，并通過流式細胞儀進行檢測。PBMCs轉(zhuǎn) 染24 h后，每 孔 加 入1 μL anti-αCD3/CD28 Dynabeads（美國Thermo Fisher Scientific公司）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在繼續(xù)培養(yǎng)結(jié)束前6 h每孔加入1 μL Golgistop（美國BD公司）。將細胞重懸，使用流式熒光表面抗體Percp-anti-CD3、FITC-anti-CD4、PE（phycoerythrin）-Cy7-anti-CD8進行染色，并置于4 ℃下避光染色30 min。加入LiveDead（美國Life Technologies公司）1 μL，4 ℃避光染色30 min。用FACS緩沖液洗滌2次，加入Cytofix/Cytoperm試劑（美國BD公司）350 μL，4 ℃避光染色40 min。將細胞重懸使用allophycocyanin（APC）-anti-IL-4、BV421-anti-IFN-γ，并置于4 ℃下避光染色30 min。用FACS緩沖液重新懸浮細胞，通過流式細胞儀FaccantoⅡ（美國BD公司）檢測后，利用FlowJo軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較，采用Spearman進行等級相關(guān)性分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism 7.0繪圖軟件進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 HIV感染者及健康對照者Th1和Th2細胞的細胞因子胞內(nèi)表達

為了測定HIV感染者及健康對照者Th1和Th2細胞因子分泌水平，對CD4+T細胞中Ⅰ型細胞因子IFN-γ和Ⅱ型細胞因子IL-4進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV感染者CD4+T細胞IFN-γ表達顯著低于健康對照者［分別為（3.62±0.87）%和（4.77±0.50）%，P=0.041，圖1A］；IL-4表達顯著高于健康對照者［分別為（8.77±1.37）%和（1.33±0.51）%，P＜ 0.001，圖1B］。提示HIV感染導致細胞因子從Th1型向Th2型漂移。

圖1 HIV感染者及健康對照者Th1和Th2細胞的細胞因子胞內(nèi)表達Fig.1 Intracellular expression of cytokines in Th1 and Th2 cells from HIV-infected patients versus healthy controls

2.2 HIV感染者TCF1調(diào)節(jié)CD4+ T細胞的細胞因子胞內(nèi)表達

HIV感染者敲除TCF1后，CD4+T細胞胞內(nèi)表達的Ⅰ型細胞因子IFN-γ 增加，差異有統(tǒng)計學意義［si-TCF1組（5.03±1.54）%，TCF1組（3.23±1.19）%，P=0.048，圖2A］；CD4+T細胞胞內(nèi)表達的Ⅱ型細胞因子IL-4減少，差異有統(tǒng)計學意義［si-TCF1組（4.48±1.66）%，TCF1組（7.58±0.94）%，P=0.004，圖2B］。提示在敲除了HIV感染者TCF1后，使HIV感染者體內(nèi)Th2細胞向Th1細胞方向漂移。

圖2 TCF1對HIV感染者CD4+ T細胞中IFN-γ和IL-4的調(diào)節(jié)作用Fig.2 Regulation of IFN-γ and IL-4 by TCF1 in CD4+ T cells from HIV-infected patients

2.3 HIV感染者TCF1調(diào)節(jié)CD8+ T細胞的細胞因子胞內(nèi)表達

圖3 TCF1對HIV感染者CD8+ T細胞中IFN-γ和IL-4的調(diào)節(jié)作用Fig.3 Regulation of IFN-γ and IL-4 by TCF1 in CD8+ T cells from HIV-infected patients

TCF1被敲除后，HIV感染者CD8+T細胞胞內(nèi)表達的Ⅰ型細胞因子IFN-γ 增加，差異有統(tǒng)計學意義［si-TCF1組（3.58±0.58）%，TCF1組（1.93±0.43）%，P＜ 0.001，圖3A］；CD8+T細胞胞內(nèi)表達的Ⅱ型細胞因子IL-4減少，差異有統(tǒng)計學意義［si-TCF1組（2.40±0.53）%，TCF1組（3.88±1.01）%，P=0.010，圖3B］。

3 討論

在人體正常生理條件下，機體Th1/Th2細胞處于動態(tài)平衡狀態(tài)，在病理狀態(tài)下，這種平衡狀態(tài)被打破，出現(xiàn)Th1/Th2細胞漂移。有研究［11］發(fā)現(xiàn)，器官特異性自身免疫病以及胞內(nèi)病原體如結(jié)核等，Th細胞亞群向Th1漂移。而系統(tǒng)性自身免疫病、過敏、哮喘及腫瘤等，則出現(xiàn)由Th1向Th2的漂移。以往研究顯示，HIV感染中，HIV基因中類過敏原結(jié)構(gòu)可誘導Ⅱ型細胞因子IL-4產(chǎn)生增加，通過上調(diào)CXCR4等促進合胞體形成病毒的復制，從而加速疾病進展；而Ⅱ型細胞因子增加，進一步抑制CD4+T細胞向Th1的分化，降低了其對細胞毒性T淋巴細胞的輔助作用，抑制了抗病毒細胞免疫應答，從而加速疾病進展［12］。本研究還證實，HIV感染后，與健康對照者相比，Ⅰ型細胞因子IFN-γ表達下降，Ⅱ型細胞因子IL-4表達升高，出現(xiàn)Th1向Th2的漂移，如何控制HIV感染中Th細胞亞群的失衡對于疾病進展的控制至關(guān)重要。

TCF1對T淋巴細胞的發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，可促進記憶性T細胞的產(chǎn)生［13］。有學者發(fā)現(xiàn)，在TCF1的調(diào)控下活化的小鼠CD4+T細胞分化為Th1或Th2細胞，誘導Th2細胞早期表達，對Th1細胞起到負調(diào)控的作用［14］，但在HIV感染中TCF1是否調(diào)控Th1/Th2的平衡尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除TCF1后，HIV感染者Th1細胞中的IFN-γ表達增加，Th2細胞中的IL-4表達下降，使得從Th2型向Th1型漂移，提示TCF1有助于糾正HIV感染者Th1/Th2的失衡。此外，研究［15-16］顯示，在一些低CD4+T細胞的HIV感染者中，外周血及皮膚均檢出以分泌IL-4等Ⅱ型細胞因子為主的CD8+T細胞，提示CD8+T細胞分泌Ⅱ型細胞因子與疾病進展相關(guān)。而CD8+T細胞分泌Ⅰ型細胞因子IFN-γ下降，亦是其功能下降的重要標志。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，敲除TCF1后，HIV感染者CD8+T細胞中Ⅰ型細胞因子IFN-γ表達增加，Ⅱ型細胞因子IL-4表達下降，提示敲除TCF1亦有助于恢復HIV感染中CD8+T細胞的平衡及功能。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)敲除TCF1有助于重建HIV感染中T細胞的免疫平衡及功能，為明確HIV感染的致病機制及免疫干預手段提供重要信息。