樊梅 唐 芳 馬武開(kāi) 蘭維婭

【摘 要】目的：從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度研究桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松癥的主要活性成分及多維藥理作用機(jī)制。方法：從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)中提取桃紅四物湯的化學(xué)成分，以口服生物利用度OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18篩選活性成分，通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)提取活性成分作用靶點(diǎn)，以GeneCards和OMIM在線分析平臺(tái)挖掘靶點(diǎn)相關(guān)疾病，采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建活性成分?作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，String10.0構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，最后通過(guò)基因本體（GO）和基因組百科全書（KEGG）富集分析桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松癥的藥理作用機(jī)制。結(jié)果：共篩選得到桃紅四物湯69個(gè)活性成分，涉及5346個(gè)作用靶點(diǎn)，主要涉及破骨細(xì)胞分化，激素，相關(guān)炎癥因子，甲狀旁腺激素的合成、分泌及作用等生物過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-17、輔助性T細(xì)胞17、T細(xì)胞受體、Toll樣受體、雌激素、絲裂原活化蛋白激酶、PI3K-Akt、甲狀腺激素、FoxO、Wnt等信號(hào)通路發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松癥的作用。結(jié)論：本研究體現(xiàn)了桃紅四物湯多成分?多靶點(diǎn)?多途徑的作用特點(diǎn)，為進(jìn)一步開(kāi)展桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松癥作用機(jī)制的研究提供了新的思路與方法。

【關(guān)鍵詞】 骨質(zhì)疏松癥;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);桃紅四物湯;活性成分;作用機(jī)制

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種全身性骨骼疾病，表現(xiàn)為骨組織微結(jié)構(gòu)退行性變和低骨量，引起骨的脆性和骨折的敏感性增加。各年齡段骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率都在增加，女性患骨折的風(fēng)險(xiǎn)是男性的2倍。隨著我國(guó)社會(huì)進(jìn)入人口老齡化階段，本病的發(fā)病率將持續(xù)升高[1]。OP主要以雙膦酸鹽類作為一線治療藥物，其次是核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體（RANKL）抑制劑。甲狀旁腺素（甲狀旁腺激素的一個(gè)片段）是只有經(jīng)批準(zhǔn)的合成代謝劑，激素替代療法（HRT）包括大量雌激素或雌激素加孕激素聯(lián)合制劑，其中一些被批準(zhǔn)用于預(yù)防絕經(jīng)后骨折高危婦女的OP，補(bǔ)充鈣和維生素D經(jīng)常被認(rèn)為是治療OP的輔助手段[2]。盡管這些策略對(duì)OP有很好的療效，但研究顯示長(zhǎng)期服用這些藥物具有較大的不良反應(yīng)，如對(duì)胃腸道損害、耐藥等。因此，尋求一種安全有效治療OP的藥物具有重要的臨床意義[3]。

OP屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”“虛勞”“骨痹”“骨枯”等范疇。許多中草藥及經(jīng)典古方在辨證論治基礎(chǔ)上治療OP得到了良好的應(yīng)用，在臨床上取得了較好的療效[4]。桃紅四物湯最早出自清·吳謙所著《醫(yī)宗金鑒》，是由四物湯加桃仁、紅花而成，也稱加味四物湯，全方有活血化瘀、養(yǎng)血補(bǔ)血的作用，是治療血瘀證的常用方。四物湯中當(dāng)歸、川芎為血中之氣藥，熟地黃、白芍為血中之血藥，加上桃仁、紅花的活血作用，全方具有養(yǎng)血而不滯血、活血而不傷血的功效[5]。楊國(guó)柱等[6]利用潑尼松誘導(dǎo)斑馬魚OP模型評(píng)價(jià)桃紅四物湯抗OP作用的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯對(duì)斑馬魚OP模型有明顯的治療作用。此外，很多研究都表明，桃紅四物湯具有治療OP的作用，這也體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療OP具有很大的優(yōu)勢(shì)及潛力。桃紅四物湯在中醫(yī)藥治療OP的臨床實(shí)踐中雖得到廣泛的運(yùn)用，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及具體作用機(jī)制尚不清楚，這是限制其臨床廣泛運(yùn)用的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，基于桃紅四物湯所含有效成分的復(fù)雜性、多樣性，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討桃紅四物湯對(duì)OP的藥理作用機(jī)制，并基于藥物、靶點(diǎn)和OP靶點(diǎn)之間的關(guān)系建立藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)，希望能為深入了解桃紅四物湯治療OP提供一定的參考依據(jù)。

1 研究方法

1.1 桃紅四物湯所含化合物的收集與篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）收集桃紅四物湯中桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃6味藥的成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為限定條件對(duì)所收集到的化合物進(jìn)行篩選。

1.2 桃紅四物湯所含化合物作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 對(duì)1.1中化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 OP發(fā)病靶點(diǎn)檢索及桃紅四物湯作用OP相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）將所得藥物靶點(diǎn)ID轉(zhuǎn)換成GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）的基因名稱。以“osteoporosis”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)收集與OP相關(guān)的基因，取得分≥0.4的靶點(diǎn)，將挖掘得到的OP相關(guān)基因與桃紅四物湯靶點(diǎn)基因互相映射篩選出共同靶點(diǎn)，獲得桃紅四物湯治療OP的作用靶點(diǎn)。

1.4 桃紅四物湯所含化合物作用OP相關(guān)靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將每個(gè)化合物與其作用的OP靶點(diǎn)相聯(lián)系，通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行桃紅四物湯的成分-OP相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，利用軟件中的Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度和介數(shù)中心度。

1.5 桃紅四物湯對(duì)OP作用靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了說(shuō)明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將桃紅四物湯相關(guān)靶點(diǎn)基因上傳至在線String10.0軟件（https：//string-db.org/），選擇研究物種為人類，設(shè)置靶點(diǎn)之間最低要求聯(lián)系分?jǐn)?shù)為0.4，并隱藏不與其他靶點(diǎn)聯(lián)系的靶點(diǎn)，構(gòu)建由導(dǎo)入基因表達(dá)產(chǎn)物組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，并且利用R語(yǔ)言3.6.1軟件（https：//www.r-project.org/）對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白繪制條形圖。

1.6 桃紅四物湯治療OP預(yù)測(cè)靶點(diǎn)富集分析 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，以P < 0.05作為篩選條件獲得靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析及基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，包括生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能3個(gè)部分。

2 結(jié) 果

2.1 活性化合物的篩選 為了提供更準(zhǔn)確的結(jié)果，本研究挑選TCMSP中OB≥30%、DL≥0.18的化合物，共檢索出730個(gè)化合物，其中桃仁66個(gè)、紅花189個(gè)、當(dāng)歸125個(gè)、川芎189個(gè)、白芍85個(gè)、熟地黃76個(gè)，通過(guò)篩選得出69個(gè)活性化合物，如谷甾醇α1、β-胡蘿卜素、黃芩苷、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、槲皮素、豆甾醇、芍藥總黃酮、芍藥苷、兒茶素等。

2.2 桃紅四物湯所含化合物作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 對(duì)2.1中化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，共得到5346個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.3 桃紅四物湯靶點(diǎn)與OP靶點(diǎn)相互作用韋恩圖 依據(jù)Relevance score≥4標(biāo)準(zhǔn)，按分子-靶蛋白對(duì)接結(jié)果篩選出相關(guān)靶蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱，如遇PBD ID對(duì)應(yīng)多個(gè)基因，則核對(duì)靶蛋白內(nèi)容選擇基因，確保1個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)1個(gè)基因。結(jié)果，共得到199個(gè)靶基因，再依據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘得到OP相關(guān)基因615個(gè)，最后將桃紅四物湯活性成分-OP靶點(diǎn)相關(guān)基因映射，共發(fā)現(xiàn)41個(gè)共同基因，確定為桃紅四物湯治療OP的靶基因。見(jiàn)圖1。

2.4 桃紅四物湯靶點(diǎn)-OP相互作用網(wǎng)絡(luò) 將候選化學(xué)成分與OP靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape 3.7.2建立桃紅四物湯成分靶點(diǎn)-OP靶點(diǎn)群網(wǎng)絡(luò)，得出桃紅四物湯靶點(diǎn)-OP網(wǎng)絡(luò)主要由56個(gè)節(jié)點(diǎn)（13個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，43個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和115條邊組成，其中菱形節(jié)點(diǎn)紅色表示疾病OP，六邊形紫色表示藥物，黃色三角形節(jié)點(diǎn)表示桃紅四物湯藥物活性成分，圓形綠色節(jié)點(diǎn)表示桃紅四物湯可能是通過(guò)這些基因治療OP，連接化合物與靶點(diǎn)的每條邊表示桃紅四物湯活性成分與OP靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。見(jiàn)圖2。在桃紅四物湯靶點(diǎn)-OP靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，桃紅四物湯中有13種主要成分作用于OP相關(guān)靶點(diǎn)，充分體現(xiàn)了其多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。其主要的化合物有β-谷甾醇、木脂素、6-羥基山奈酚、黃芩素、槲皮素、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、芍藥苷、兒茶素、肉豆蔻堿等，這些藥物的活性成分可能是治療OP的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.5 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因分析 PPI網(wǎng)絡(luò)包含41個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn)，共有403條相互作用連線。見(jiàn)圖3。其中度值較大的有白細(xì)胞介素（IL）-6（度值 = 38）、IL-B（度值 = 35）、JUN（度值 = 32）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9，度值 = 30）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF，度值 = 28）、低聚果糖（FOS，度值 = 28）等，它們與其他蛋白相互作用，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。見(jiàn)圖4。

2.6 GO生物過(guò)程分析 將41個(gè)靶基因在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物過(guò)程富集，根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR） < 0.05篩選出62個(gè)GO生物過(guò)程。其中受體調(diào)節(jié)活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、受體配體活性、染色質(zhì)結(jié)合活性等位于GO生物過(guò)程富集的前面。見(jiàn)圖5、圖6。OP的發(fā)生、發(fā)展涉及蛋白質(zhì)的活性、轉(zhuǎn)錄因子的活性、DNA及RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過(guò)程，而桃紅四物湯可通過(guò)調(diào)節(jié)以上生物過(guò)程治療OP。

2.7 KEGG信號(hào)通路分析 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)將桃紅四物湯的41個(gè)靶基因在KEGG信號(hào)通路中富集，根據(jù)FDR < 0.05篩選出與OP密切相關(guān)的信號(hào)通路，包括IL-17、輔助性T細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞、T細(xì)胞受體、Toll樣受體、雌激素、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K-Akt、甲狀腺激素、FoxO、Wnt等信號(hào)通路。其中每條通路都有相對(duì)應(yīng)的通路圖，涉及破骨細(xì)胞分化，激素，相關(guān)炎癥因子，甲狀旁腺激素的合成、分泌及作用等生物過(guò)程。由此推測(cè)，桃紅四物湯可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)以上關(guān)鍵基因，影響此類信號(hào)通路發(fā)揮治療OP的作用。KEGG富集通路的柱狀圖，見(jiàn)圖7。

3 討 論

OP是一種以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)破壞為主要特征的全身性疾病，臨床上以全身骨痛及易于發(fā)生骨折為主要表現(xiàn)，尤以老年人及絕經(jīng)后婦女多見(jiàn)，隨著我國(guó)人口老齡化加快，其分型又以絕經(jīng)后OP為常見(jiàn)[7-8]。季兆潔等[9]發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯具有顯著的促進(jìn)骨折愈合作用，促進(jìn)骨痂微血管的新生，顯示出良好的祛瘀生新作用。中醫(yī)藥治療OP具有價(jià)格低廉、劑型豐富、不良反應(yīng)小、依從性好等優(yōu)勢(shì)，在治療早中期OP方面發(fā)揮著不可替代的作用[10]。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)對(duì)中藥的收集整合，建立了多種中藥數(shù)據(jù)庫(kù)，以可視化的形式將各個(gè)藥物與疾病之間的關(guān)系系統(tǒng)地呈現(xiàn)出來(lái)[11]。從本研究結(jié)果來(lái)看，桃紅四物湯中關(guān)鍵的活性成分、基因參與并調(diào)控了OP的進(jìn)程，與目前已有的關(guān)于桃紅四物湯治療OP的研究相一致，為桃紅四物湯“多成分—多靶點(diǎn)—多疾病”治療OP的機(jī)制提供了參考。

從OP與桃紅四物湯的共同靶點(diǎn)來(lái)看，OP與桃紅四物湯相關(guān)的活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中包含41個(gè)靶點(diǎn)，其中度值較大的有IL-6、IL-B、JUN、MMP-9、EGF、FOS等，推測(cè)桃紅四物湯有效成分可能通過(guò)抑制上述靶點(diǎn)發(fā)揮作用。如血清IL-6可能與OP的發(fā)病有關(guān)[12]，MMP-9是破骨細(xì)胞前體的重要調(diào)節(jié)因子[13]。

本研究初步篩選出桃紅四物湯治療OP的活性成分有β-谷甾醇、木脂素、6-羥基山奈酚、黃芩素、槲皮素、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、芍藥苷、兒茶素、肉豆蔻堿等。β-谷甾醇是一種植物甾醇，在體外和體內(nèi)研究中被報(bào)道為具有抗炎、抗血管生成和降低膽固醇作用;槲皮素為一種黃酮類化合物，據(jù)報(bào)道，槲皮素可以降低因小鼠卵巢切除和骨修復(fù)而導(dǎo)致的骨完整性喪失。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種藥物具有改善骨脆性和骨折的藥理作用，能逆轉(zhuǎn)體內(nèi)外雌激素調(diào)節(jié)引起的骨重塑的衰弱狀態(tài)，維持鈣、磷水平和骨完整性[14]。有研究者利用代謝組學(xué)的方法，評(píng)價(jià)木脂素對(duì)去卵巢OP模型大鼠的療效和治療靶點(diǎn)，最終鑒定出16種潛在的生物標(biāo)志物，通過(guò)影響內(nèi)源性相關(guān)代謝機(jī)制，為絕經(jīng)后OP的治療提供了藥理依據(jù)[15]。付方勝等[16]實(shí)驗(yàn)提示，黃芩素可以通過(guò)抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能，預(yù)防破骨細(xì)胞增強(qiáng)導(dǎo)致的OP;此外，它還可通過(guò)激活mTORC1信號(hào)通路刺激MC3T3-E1細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[17]。

山奈酚是一種天然黃酮類化合物，從山奈酚根狀莖中提取，研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚對(duì)去卵巢大鼠OP的防治作用是使骨密度有顯著提高，明顯抑制大鼠尿液中骨鈣和磷的流失，能夠顯著抑制去卵巢大鼠血清中酒石酸酸性磷酸酶和組織蛋白酶K的活性，改善OP大鼠骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)[18-19]。β-胡蘿卜素能促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期分化，維持骨轉(zhuǎn)換的正平衡[20]。木犀草素是一種具有抗氧化活性的植物類黃酮。研究發(fā)現(xiàn)，其可以通過(guò)減輕氧化應(yīng)激促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并通過(guò)調(diào)節(jié)ERK/LRP-5/GSK-3β途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，在糖皮質(zhì)激素性O(shè)P的治療中發(fā)揮重要作用[21]。芍藥苷是一種天然產(chǎn)物，能提高成骨細(xì)胞活性，抑制破骨細(xì)胞活性，從而減少去卵巢引起的OP[22]。綜上所述，桃紅四物湯的有效成分之間不僅存在緊密的協(xié)同關(guān)系，而且其作用靶點(diǎn)也在整個(gè)疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。

從通路富集結(jié)果分析可知，桃紅四物湯治療OP核心基因的KEGG通路主要涉及IL-17、Th17細(xì)胞、T細(xì)胞受體、Toll樣受體、雌激素、MAPK、PI3K-Akt、甲狀腺激素、FoxO、Wnt、AGE-RAGE等。其中每條通路都有相對(duì)應(yīng)的通路圖，涉及破骨細(xì)胞分化，激素，相關(guān)炎癥因子，甲狀旁腺激素的合成、分泌及作用等生物過(guò)程。

根據(jù)本研究結(jié)果，桃紅四物湯多靶點(diǎn)、多通路治療OP的機(jī)制得到初步驗(yàn)證，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果從另一方面也說(shuō)明了引起OP因素多且復(fù)雜，為從分子水平方向進(jìn)一步揭示桃紅四物湯治療OP的潛在化學(xué)成分及作用機(jī)制，為后期藥物研發(fā)及疾病治療提供一定的理論依據(jù)。

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收稿日期：2020-02-29;修回日期：2020-04-16