明月月 吳群 牛金利 丁月霞

摘要?為了解臨床常用抗菌藥對(duì)兔源沙門(mén)氏菌的體外抑菌效果，采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定臨床常用8種抗菌藥物對(duì)病原菌的最小抑菌濃度（MIC），采用棋盤(pán)稀釋法進(jìn)行體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)測(cè)定病原菌部分的抑菌濃度指數(shù)（FIC）。結(jié)果表明，分離鑒定病原菌為沙門(mén)氏菌，慶大霉素的抑菌效果最強(qiáng)（0.125 μg/mL），其次為氧氟沙星（0.250 μg/mL）、恩諾沙星（0.500 μg/mL），磺胺嘧啶鈉（8.000 μg/mL）、磺胺間甲氧嘧啶與阿米卡星（均為16.000 μg/mL）抑菌效果較差，而阿莫西林與青霉素的抑菌效果最差（均為128.000 μg/mL）。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，阿莫西林與氧氟沙星、慶大霉素與氧氟沙星聯(lián)用呈協(xié)同作用，阿米卡星與磺胺嘧啶鈉、阿米卡星與磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星與阿米卡星聯(lián)用呈無(wú)關(guān)作用，氧氟沙星與磺胺間甲氧嘧啶、青霉素與阿米卡星、慶大霉素與磺胺嘧啶鈉聯(lián)用呈拮抗作用。

關(guān)鍵詞?兔源沙門(mén)氏菌，抗菌藥，最小抑菌濃度（MIC），聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)?S855.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）06-0074-03

Abstract?In order to understand antimicrobial effect of the clinical commonly used antimicrobial agents on salmonella from rabbit in vitro，we used eight kinds of antimicrobial drugs against pathogens to investigate the minimum inhibitory concentration （MIC） of the clinical commonly，and the fractional inhibitory concentration （FIC index） of some antimicrobial agents against pathogens was determined by the chessboard dilution method of microbroth.The results showed that the isolated and identified pathogenic was Salmonella sp..And antibacterial drugs of gentamicin performed well with MIC of 0.125 μg/mL，?followed by xfloxacin （0.250 μg/mL） and enrofloxacin（0.500 μg/mL），the sulfadiazine sodium（8.000 μg/mL），sulfamonomethoxine and amikacin（both 16.000 μg/mL） have even lower antimicrobial effect，?amoxicillin and penicillin showed the worst antimicrobial effect，with MIC both of 128.000 μg/mL.By combining with drug sensitive test results，the combination of amoxicillin and ofloxacin，gentamicin and ofloxacin showed a synergy effect.But the combination of amikacin and sulfadiazine sodium，amikacin and sulfamonomethoxine，enrofloxacin and amikacin showed no correlation.Penicillin and amikacin，gentamicin and sulfadiazine sodium had a combination role in antagonism.The combination of xfloxacin and sulfamonomethoxine，penicillin and amikacin，gentamicin and sulfadiazine sodium showed antagonism.

Key words?Salmonella from rabbit，Antibiotics，Minimum inhibitory concentration （MIC），Combined drug sensitiveness test

沙門(mén)氏菌是腸桿菌科中最常見(jiàn)的病原菌之一，為兩端鈍圓、無(wú)莢膜、無(wú)芽孢、周身鞭毛、大部分都具有菌毛的革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生短腸桿菌[1]。沙門(mén)氏菌在自然界中廣泛分布，至今已檢測(cè)出血清型2 500余種，我國(guó)已有292個(gè)血清型的報(bào)道[2]，能引起畜禽、犬貓等多種動(dòng)物感染疾病，也可導(dǎo)致人類食物中毒，具有廣泛的致病性[3]。據(jù)調(diào)查，我國(guó)由沙門(mén)氏菌引起的食源性疾病占70%～80%，有相當(dāng)一部分人感染沙門(mén)氏菌與食用沙門(mén)氏菌污染的動(dòng)物性食品有關(guān)[4]。兔副傷寒病，即兔沙門(mén)氏菌病，是由鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌這兩種病原菌引起的兔消化道疾病。雖然兔子不是沙門(mén)氏菌的主要宿主，且關(guān)于家兔感染沙門(mén)氏菌的報(bào)道較少，但我國(guó)是世界上兔肉生產(chǎn)和出口大國(guó)[5]，兔肉品質(zhì)、衛(wèi)生以及安全顯得格外重要。在實(shí)際生產(chǎn)中，沙門(mén)氏菌病可用抗生素治療，但不合理使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性[6]等問(wèn)題。如今耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，曾經(jīng)高效的抗菌藥現(xiàn)已逐漸落下帷幕，而合理的聯(lián)合用藥可擴(kuò)大抗菌譜，增強(qiáng)療效減少用量，延緩或降低耐藥性的產(chǎn)生。為減少生產(chǎn)中沙門(mén)氏菌所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失，如何有效合理利用抗菌藥控制沙門(mén)氏菌成為當(dāng)前討論的熱點(diǎn)。筆者通過(guò)微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定8種抗生素對(duì)分離鑒定的兔源沙門(mén)氏菌的MIC值，采用棋盤(pán)稀釋法進(jìn)行體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)兔源沙門(mén)氏菌的部分抑菌濃度指數(shù)（FIC），旨在為臨床上更有效地聯(lián)合使用抗菌藥物，防治沙門(mén)氏菌病提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株與藥物。菌株由廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診病例垂耳兔肛門(mén)拭子分離。

恩諾沙星（批號(hào)為170524），購(gòu)自廣東?？但F藥有限公司，磺胺間甲氧嘧啶磺胺（批號(hào)為20180120）、磺胺嘧啶鈉（批號(hào)為20180210）均購(gòu)自上海騎驃動(dòng)物保健品有限公司，阿米卡星（批號(hào)為180101）和慶大霉素（批號(hào)為180170）購(gòu)自海南海靈化學(xué)制藥有限公司，阿莫西林（批號(hào)為20131108），購(gòu)自四川鼎尖動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司，青霉素（批號(hào)為131105），購(gòu)自華北制藥股份有限公司，氧氟沙星（批號(hào)為20150213），購(gòu)自鶴山市南華動(dòng)物藥業(yè)有限公司。

1.1.2?主要試劑與儀器。

營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，革蘭氏染色液和麥康凱瓊脂均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，細(xì)菌微量生化鑒定盒購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司，干燥箱、生化培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、博迅蒸餾水器、電子分析天平、超凈工作臺(tái)等主要儀器。

1.2?方法

1.2.1?藥液的制備。

用無(wú)菌生理鹽水配制抗生素藥液，初始濃度為1 280 μg/mL （磺胺類抗生素為2 560 μg/mL），溶解后置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?致病菌鑒定及菌液制備。

將病料接種于滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃下培養(yǎng)24 h后，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑單個(gè)菌落于麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取透明或半透明的白色單個(gè)菌落革蘭氏染色并鏡檢，觀察其形態(tài)特征，并與沙門(mén)氏菌形態(tài)特征進(jìn)行對(duì)比。挑選疑似菌株，活化后取20 μL菌液加入微量生化管中封閉。在相應(yīng)溫度培養(yǎng)24～48 h后，觀察培養(yǎng)結(jié)果并對(duì)照《腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)》確定菌株菌屬。無(wú)菌挑取已分離鑒定的單個(gè)菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃下培養(yǎng)24 h后，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線37 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落接種于2 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，吸取0.5 mL菌液，將菌液用肉湯按0.1倍梯度稀釋至細(xì)菌含量為1×105 CFU/mL（與0.5麥?zhǔn)媳葷峁艿臏啙岫葘?duì)比），備用。

1.2.3?單藥MIC測(cè)定與結(jié)果判定。

采用微量肉湯法二倍稀釋法，在96孔板上添加供試菌液：第1列均添加180 μL，其余各孔均添加100 μL至第11孔，第12孔作為空白對(duì)照（即陰性對(duì)照）。取20 μL對(duì)應(yīng)供試藥物分別加入相應(yīng)藥物的1號(hào)孔，用移液槍吹吸混勻后吸出100 μL加至2號(hào)孔，同理按順序稀釋至11號(hào)孔，棄去100 μL。1～12號(hào)孔的藥物含量依次為128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0 μg/mL。每種藥物進(jìn)行2組平行對(duì)照。稀釋結(jié)束將96孔板置于生化恒溫箱37 ?℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：孔內(nèi)肉湯呈明顯混濁判為陽(yáng)性，肉湯呈清亮無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為最小抑菌濃度。

1.2.4?聯(lián)合藥敏試驗(yàn)測(cè)FIC指數(shù)與結(jié)果判定。

采用棋盤(pán)稀釋法進(jìn)行體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，測(cè)定FIC指數(shù)，以單藥對(duì)供試菌MIC值為中心濃度，對(duì)其16.00倍、8.00倍、4.00倍、2.00倍、1.00倍、0.50倍、0.25倍濃度分別進(jìn)行聯(lián)合，并設(shè)置甲藥、乙藥的單藥對(duì)照及菌液陽(yáng)性對(duì)照和肉湯陰性對(duì)照。采用二倍稀釋法制備A、B抗生素菌藥液，在試管架上擺2排7支試管，第1排稀釋A抗生素、第2排稀釋B抗生素。將第1排每個(gè)試管中分別加入2 mL標(biāo)準(zhǔn)菌液后，在第1管加入2 mL 32.00 MIC 的A藥液，混勻后吸取2 mL到第2管，依次稀釋至第7管，最后1管棄去2 mL，按上述方法所得1～7號(hào)孔的A藥物濃度依次為16.00 MIC、8.00 MIC、4.00 MIC、2.00 MIC、1.00 MIC、0.50 MIC、0.25 MIC。按此方法配制B抗生素菌藥液。在96孔板上，將1～7號(hào)A菌藥液管分別依次加入100 μL于1～7排的前8個(gè)孔，將1～7號(hào)B菌藥液管分別依次加100 μL于1～7列的前8個(gè)孔，其第8排作為B藥單藥對(duì)照，第8列作為A藥單藥對(duì)照，第8排的第8列孔中加200 μL菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照。結(jié)果判斷如下：底部對(duì)光觀察，肉湯渾濁為陽(yáng)性，否則為陰性，以FIC值為判斷依據(jù)：FIC=甲藥單藥MIC/甲藥單藥MIC+乙藥單藥MIC/乙藥單藥MIC，若FIC≤0.5，則為協(xié)同作用，若0.52.0，則為拮抗作用。

2?結(jié)果與分析

2.1?致病菌鑒定

2.1.1?菌落形態(tài)觀察。在麥康凱瓊脂平板上，菌落呈白色凸起，邊緣圓潤(rùn)。挑單個(gè)菌落革蘭氏染色并鏡檢，呈現(xiàn)紅色短桿菌。

2.1.2?微量生化管鑒定。將生化鑒定結(jié)果對(duì)照《腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)》進(jìn)行編碼，得出編碼結(jié)果為611，見(jiàn)表1，結(jié)果顯示該菌種為沙門(mén)氏菌。

2.2?單藥最小抑菌濃度（MIC）

由表2可知，慶大霉素的抑菌效果最強(qiáng)（0.125 μg/mL），而氧氟沙星（0.250 μg/mL）、恩諾沙星（0.500 μg/mL）、磺胺嘧啶鈉（8.000 μg/mL）、磺胺間甲氧嘧啶與阿米卡星（均為16.000 μg/mL）抑菌效果較差，而阿莫西林與青霉素的抑菌效果最差（均為128.000 μg/mL）。

2.3?2種抗生素的體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，阿莫西林+氧氟沙星、慶大霉素+氧氟沙星呈協(xié)同作用，F(xiàn)IC指數(shù)均大于等于0.5，阿米卡星+磺胺嘧啶鈉、阿米卡星+磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星+阿米卡星呈無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)IC指數(shù)均介于1.0～2.0（含2.0），氧氟沙星+磺胺間甲氧嘧啶、青霉素+阿米卡星、慶大霉素+磺胺嘧啶鈉呈拮抗作用，F(xiàn)IC指數(shù)大于2.0。

3?討論

3.1?單藥最小抑菌濃度（MIC）

該試驗(yàn)結(jié)果表明，各藥物的抑菌效果從大到小依次為慶大霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、磺胺嘧啶鈉、磺胺間甲氧嘧啶、阿米卡星、阿莫西林、青霉素，8種抗生素對(duì)分離菌株產(chǎn)生抑菌作用的程度差異可能是因?yàn)椴煌惪股刈饔脵C(jī)制不同[7]、抑菌作用范圍或菌株耐藥程度不同。

慶大霉素與阿米卡星為氨基糖苷類抗生素（AGs），屬于廣譜高效殺菌性抗生素，對(duì)需氧G-桿菌抑菌效果好，對(duì)G+效果較差，對(duì)厭氧菌無(wú)效。AGs作用機(jī)制[8]是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，迄今仍對(duì)革蘭氏陰性菌感染起到良好效果，并在臨床生產(chǎn)中廣泛使用。劉振波等[9]試驗(yàn)結(jié)果表明，慶大霉素對(duì)創(chuàng)傷弧菌敏感性強(qiáng)。牛江婷等[10]研究表明慶大霉素對(duì)兔支氣管敗血波氏桿菌有較強(qiáng)抑菌作用，并與該研究中慶大霉素的抑菌效果相符，阿米卡星效果比慶大霉素的效果差，可能該兔源沙門(mén)氏菌菌株已產(chǎn)生對(duì)阿米卡星的耐藥性。氧氟沙星與恩諾沙星屬于喹諾酮類抗生素，其是廣譜、高效、殺菌力強(qiáng)的一類化學(xué)合成抗菌藥物，抑制細(xì)菌DNA回旋酶，阻斷DNA合成和復(fù)制致細(xì)菌死亡，在該試驗(yàn)中對(duì)沙門(mén)氏菌產(chǎn)生了一定的抑菌作用?；前粪奏もc與磺胺間甲氧嘧啶屬于磺胺類抗生素，是廣譜、慢作用型抑菌藥物，對(duì)大多數(shù)G+菌和部分G-菌有效，對(duì)沙門(mén)氏菌較為敏感，它們?cè)谠撛囼?yàn)中抑菌效果較好，但抗菌活性較弱，與其他抗菌藥物聯(lián)合效果更好，其主要是干擾細(xì)菌葉酸代謝而抑制其生長(zhǎng)繁殖。阿莫西林與青霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，殺菌力強(qiáng)，對(duì)G+菌、部分G-球菌及G+球菌等高度敏感，毒性低，但細(xì)菌可產(chǎn)生相應(yīng)的酶破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)，是產(chǎn)生耐藥性的主要原因。但這2種抗生素在該試驗(yàn)中效果并不理想。

3.2?2種抗生素體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

聯(lián)合試驗(yàn)中，抗菌藥物可表現(xiàn)為協(xié)同、相加、無(wú)關(guān)、拮抗4種作用，抗生素可根據(jù)其對(duì)細(xì)菌作用方式分為四大類：青霉素與阿莫西林屬于 Ⅰ 類抗生素（繁殖期殺菌藥），可阻斷粘肽的合成，影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的殺菌效果，慶大霉素、阿米卡星、恩諾沙星與氧氟沙星屬于Ⅱ類抗生素（靜止期殺菌藥），對(duì)靜止期細(xì)菌有較強(qiáng)殺滅作用，阻礙蛋白質(zhì)合成，磺胺嘧啶鈉與磺胺間甲氧嘧啶屬于Ⅳ類抗生素（慢效抑菌藥），作用于細(xì)菌葉酸轉(zhuǎn)化，影響菌體合成蛋白質(zhì)。

協(xié)同作用組：阿莫西林+氧氟沙星是Ⅰ 類+Ⅱ類聯(lián)合可能呈現(xiàn)協(xié)同作用，該試驗(yàn)結(jié)果與理論相符，也與李榮譽(yù)等[11]研究結(jié)果一致，對(duì)慶大霉素與氧氟沙星來(lái)說(shuō)，同類抗生素不宜聯(lián)用，但作用點(diǎn)不同的抗生素可以聯(lián)用，如慶大霉素與喹諾酮類、磺胺藥與抗菌增效劑等可阻礙蛋白質(zhì)合成的不同環(huán)節(jié)，可產(chǎn)生增強(qiáng)或相加作用[12]，在該試驗(yàn)中呈現(xiàn)協(xié)同作用，與肖華平等[13]試驗(yàn)結(jié)果相一致。無(wú)關(guān)作用組：阿米卡星+磺胺嘧啶鈉、阿米卡星+磺胺間甲氧嘧啶屬于Ⅱ類+Ⅳ類聯(lián)用，可獲協(xié)同或相加作用，恩諾沙星與阿米卡星同為Ⅱ類抗生素，影響菌體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的不同環(huán)節(jié)，所以在聯(lián)合用藥可產(chǎn)生增強(qiáng)或相加作用，此外在劉玲紅[14]的試驗(yàn)結(jié)果中也呈現(xiàn)出良好的抑菌效果，但該試驗(yàn)中呈現(xiàn)出無(wú)關(guān)作用，在單藥抑菌效果中阿米卡星效果比慶大霉素效果差，可能是該兔源沙門(mén)氏菌菌株已產(chǎn)生對(duì)阿米卡星的耐藥性，影響了這3組的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果。拮抗作用組：慶大霉素+磺胺嘧啶鈉、氧氟沙星+磺胺間甲氧嘧啶均屬于Ⅱ類+Ⅳ類聯(lián)用，可獲協(xié)同或相加作用，但該試驗(yàn)結(jié)果與理論不符，可能是因磺胺類藥物易堿化產(chǎn)生沉淀而導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生誤差，青霉素+阿米卡星屬于Ⅰ類+Ⅱ類聯(lián)合，可獲協(xié)同作用[13]，而該試驗(yàn)聯(lián)合用藥產(chǎn)生拮抗作用，是否與此時(shí)氨基糖苷類產(chǎn)生抑菌作用有關(guān)則有待進(jìn)一步研究。

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