張麗姿，高涵，田益玲，陸文靜，何俊萍

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北保定 071000）

我國(guó)酒文化底蘊(yùn)深厚、源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，幾乎對(duì)每一位炎黃子孫都有影響[1]。酒是由醇、水、酸、酮以及雜環(huán)化合物等有機(jī)化合物組成的，其中水和乙醇（又名酒精）的含量約為98%，并且對(duì)人體傷害最大的成分就是乙醇[2]。醫(yī)學(xué)證明，適量飲酒可以消除疲勞、促進(jìn)睡眠、活血通絡(luò)，但是過(guò)量飲酒則會(huì)危害人體健康。通過(guò)一些發(fā)達(dá)國(guó)家的研究表明，很多死亡率和發(fā)病率較高的疾病都在一定程度上和酒精相關(guān)疾病有關(guān)[3]。醉酒和酒精中毒已成為我國(guó)公共衛(wèi)生問(wèn)題，它在給家庭、社會(huì)帶來(lái)極大的危害的同時(shí)，也對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等多系統(tǒng)造成一定的傷害。有資料顯示，大量急性飲酒可引起頭疼、惡心、嘔吐、注意力不集中、記憶力減退、情緒不穩(wěn)定、意識(shí)和行為失控導(dǎo)致的交通事故以及急性死亡等嚴(yán)重后果[4-6]。如果長(zhǎng)期飲酒則會(huì)引起酒精性肝病、肝硬化、食管癌以及胃癌等。隨著社會(huì)的發(fā)展和人民物質(zhì)生活水平的提高，飲酒的同時(shí)又不醉酒成為許多人所追求的目標(biāo)。因此探討如何迅速降解酒精，保護(hù)機(jī)體肝臟是一個(gè)值得關(guān)注的熱門課題[7-10]。

紅樹(shù)莓不僅果實(shí)中含有鞣花酸、水楊酸、黃酮和多糖等活性成分，而且其枝葉中也含有一些果實(shí)中特有的活性成分。但每年樹(shù)莓產(chǎn)果后的枝條都會(huì)被砍掉，而造成大面積的浪費(fèi)和環(huán)境污染等問(wèn)題。食用菌類不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有獨(dú)特的藥用保健價(jià)值。本試驗(yàn)用廢棄的樹(shù)莓枝條取代普通的木屑添加到平菇菌袋中充當(dāng)培養(yǎng)基，經(jīng)驗(yàn)證所培育的平菇中鞣花酸含量為0.219 mg/g（干重），而未使用紅樹(shù)莓枝培育的平菇中鞣花酸含量幾乎為0，由于紅樹(shù)莓中富含的鞣花酸和其聚合物以及其他化合物具有解酒功能，故結(jié)合傳統(tǒng)藥膳進(jìn)行平菇解酒片的開(kāi)發(fā)。

最優(yōu)混料設(shè)計(jì)是一種將D-最優(yōu)化設(shè)計(jì)應(yīng)用于混料試驗(yàn)中的設(shè)計(jì)方法[11]，該試驗(yàn)方法主要研究響應(yīng)變量與各試驗(yàn)因素的不同比例之間的關(guān)系，只與各因素的總量有關(guān)且與各因素單個(gè)含量無(wú)關(guān)。因?yàn)榇朔椒ň哂行畔⒘砍浞?、試?yàn)次數(shù)少、多目標(biāo)同步優(yōu)化和參數(shù)預(yù)測(cè)精度高等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到化工、農(nóng)藥、農(nóng)林、食品、冶金等行業(yè)[12-14]。本試驗(yàn)使用軟件Design Expert（V.8.0.6）中的混料設(shè)計(jì)中的D-Optional方法，以小米粉、苦蕎粉、平菇粉、葛花粉、拐棗粉為主要原料設(shè)計(jì)解酒片的最佳主料配方，以體外乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）的激活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。建立各組分不同比例與ADH激活率之間的回歸模型，考察該配方中各組分的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹(shù)莓枝條：產(chǎn)于河北邢臺(tái)；小米：市售；苦蕎、葛花、拐棗：保定中藥材公司，產(chǎn)地江西；無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、焦磷酸鈉：均為分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；氧化型輔酶I（酶活≥500 U/mg）、乙醇脫氫酶（酶活≥500 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；解酒藥HANGOVER：medicura每德公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-800Y1超微粉碎機(jī)：臺(tái)灣欣鎮(zhèn)有限公司；80目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩PT20：浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；BS214D精密分析天平：上海雙旭電子有限公司；HW?SY11電熱恒溫水浴鍋：北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；UV-2008H紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海UNIC公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TD4-5K離心機(jī)：湖南易達(dá)京華儀器公司；101-0型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司。

1.3 方法

1.3.1 配方的混料設(shè)計(jì)

將A小米粉、B苦蕎粉、C蘑菇粉、D葛花粉、E拐棗粉按照Design Expert軟件設(shè)計(jì)的最優(yōu)混料設(shè)計(jì)（optimal mixture design）試驗(yàn)組合進(jìn)行配比，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1，各因子的體積總和為1。本試驗(yàn)對(duì)每種材料在配方中所占的比例進(jìn)行了限制，為了達(dá)到良好的外觀、較好的口感和理想的功效，設(shè)置蘑菇粉（C）的含量不高于 0.3，葛花粉（D）含量不高于 0.2，拐棗粉（E）含量不高于0.1，故各指標(biāo)的設(shè)定方案見(jiàn)表1所示。

表1 各指標(biāo)的設(shè)定Table 1 Settings of each indicator

1.3.2 體外乙醇脫氫酶激活率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取各粉末，充分混合均勻后取5 g混合粉末與燒杯中，定容于50 mL的容量瓶中，充分振蕩搖勻，5 000 r/min離心10 min，取上清液即為待測(cè)溶液。

乙醇脫氫酶活力測(cè)定通常采用瓦勒-霍赫法[15-18]。主要操作方法為：首先在試管中加入1.5 mL pH值為8.8的焦磷酸鈉溶液，再加入濃度為0.027 mol/L的氧化型輔酶I（NAD+）1.0 mL、濃度為11.5%的乙醇水溶液0.5 mL和0.1 mL的上述待測(cè)溶液，充分振蕩搖勻后置于25℃水浴鍋中保溫5 min，待保溫結(jié)束后立即向試管中加入0.25 U/mL的乙醇脫氫酶（ADH）0.1 mL，混勻后立即用分光光度計(jì)在340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A340，每隔10s記錄一次A340，連續(xù)記錄5 min。用0.5 mL蒸餾水代替11.5%的乙醇水溶液做調(diào)零空白對(duì)照，用0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液做陰性對(duì)照，以等體積市售的解酒藥HANGOVER（medicura每德公司）為陽(yáng)性對(duì)照。

計(jì)算每分鐘A340的增加值（△A340）值，根據(jù)生成的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）在340 nm時(shí)摩爾消光系數(shù)為6.2，計(jì)算ADH的活力單位，ADH的活力以每分鐘生成 NADH 的納摩爾（nmol/min）表示，按公式（1）計(jì)算ADH活力，并按公式（2）計(jì)算激活率：

式中：R為ADH激活率，%；U1為樣品的ADH活力；U0為陰性對(duì)照組的ADH活力。結(jié)果平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 ADH激活率的試驗(yàn)結(jié)果

按照軟件設(shè)計(jì)的試驗(yàn)組合進(jìn)行復(fù)配，共25組試驗(yàn)，試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。應(yīng)用Design-expert軟件對(duì)響應(yīng)值A(chǔ)DH激活率的試驗(yàn)值進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，建立乙醇脫氫酶激活率的回歸模型，回歸模型方程如下：

ADH激活率=+8.42A+10.43B+42.65C+67.77D-118.30E-14.13AB-61.94AC-42.22AD+133.05AE-61.66BC-47.56BD+141.65BE-87.59CD+111.45CE+244.58DE

表2 設(shè)計(jì)方案和結(jié)果Table 2 Design scheme and results

2.2 最優(yōu)混料設(shè)計(jì)方差分析

通過(guò)對(duì)模型進(jìn)行回歸與方差分析見(jiàn)表3。

表3 二次多項(xiàng)回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

由表3可知，ADH激活率的線性擬合模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），同時(shí)多元相關(guān)系數(shù) R2=0.956 4，且失擬項(xiàng)在0.05水平上不顯著，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)情況擬合較好，其中 AC、BC 達(dá)到顯著水平（P＜0.05），AB 達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），故自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著；校正后的判定系數(shù)R2Adj=0.895 2，表明該模型方程很好的擬合了ADH激活率指標(biāo)與所用主料配方的比例關(guān)系。

2.3 組分交互作用對(duì)ADH激活率的影響

在混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)中可以根據(jù)三元等值線圖直觀反映各原料組分的變化對(duì)乙醇脫氫酶激活率的影響，固定其中的兩種組分，比較其他3種組分的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。由軟件得到小米粉、苦蕎粉、蘑菇粉、葛花粉和拐棗粉交互作用的3D曲線圖和三元等值線圖如圖1所示。

從圖1中可以看出，響應(yīng)面圖均為曲面圖，說(shuō)明這5種原料粉之間具有一定的交互作用。

2.4 配方優(yōu)化

根據(jù)三角曲面試驗(yàn)結(jié)果和對(duì)各組分的限制條件，使小米粉的添加量盡可能大，因?yàn)樾∶追劭梢再x予醒酒咀嚼片獨(dú)特的香味和口感。經(jīng)Design Expert軟件優(yōu)化得到的最佳配方為：小米粉31.2%、苦蕎粉21.7%、平菇粉20.5%、葛花粉16.8%、拐棗粉9.8%，在該條件下對(duì)ADH的激活率達(dá)到最大。軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析給出了達(dá)到或者接近目標(biāo)響應(yīng)值的多個(gè)組合，并提供了預(yù)測(cè)值。對(duì)其中的5個(gè)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，每組進(jìn)行5次驗(yàn)證，去掉一個(gè)最大值和一個(gè)最小值取剩下的平均值，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表4。

圖1 小米粉、苦蕎粉、蘑菇粉、葛花粉、拐棗粉對(duì)ADH激活率交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.1 Three-dimensional surface map and contour map of the interaction of millet powder，bitter powder，mushroom powder，peony powder and jujube powder on ADH activation rate

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)Table 4 Verification test

由表4可以看出試驗(yàn)值和給出的預(yù)測(cè)值基本吻合，本試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳最佳主料配比參數(shù)準(zhǔn)確可靠，說(shuō)明該試驗(yàn)的模型擬合度較高。其中組合1對(duì)乙醇脫氫酶的激活率最高達(dá)到。

對(duì)優(yōu)化得到的最佳配方進(jìn)行復(fù)配，并與市售解酒藥HANGOVER（medicura每德公司）對(duì)乙醇脫氫酶的激活率進(jìn)行驗(yàn)證比較，結(jié)果如表5所示，說(shuō)明此方法得到的醒酒咀嚼片有一定的功效。

表5 驗(yàn)證與比較Table 5 Verification and comparison

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)的方法，以乙醇脫氫酶的激活率大小為醒酒咀嚼片的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)主料配方小米粉、苦蕎粉、蘑菇粉、葛花粉和拐棗粉的混合復(fù)配比例進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)建立評(píng)價(jià)指標(biāo)的回歸模型，對(duì)原料各組分間交互作用進(jìn)行分析比較，同時(shí)通過(guò)結(jié)合混料設(shè)計(jì)軟件的優(yōu)化功能，并通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得到最佳配方：小米粉31.2%、苦蕎粉21.7%、蘑菇粉20.5%、葛花粉16.8%、拐棗粉9.8%，在該條件下對(duì)ADH的激活率最大達(dá)到15.87%，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值相吻合，說(shuō)明該試驗(yàn)得到的模型比較可靠，可以快速有效的應(yīng)用于解酒咀嚼片的設(shè)計(jì)以及優(yōu)化中，這種方法不僅能有效的減少試驗(yàn)次數(shù)，還可以獲得較優(yōu)的配方，從而提高解酒片的品質(zhì)功能。