劉夢(mèng)蝶，李彩云，李 潔,2,3,，嚴(yán)守雷,2,3，王清章,2,3

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070）

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）是我國(guó)最具特色、栽培面積最大的水生經(jīng)濟(jì)作物，目前，蓮藕已成為我國(guó)重要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一。蓮藕水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)78%，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，貯運(yùn)過程中易于褐變和腐敗，成為制約其出口的主要因素[1-2]。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為蓮藕采后的主要腐敗菌[3]。

空氣放電保鮮法是通過采用非均電場(chǎng)無聲放電或電暈放電使空氣電離產(chǎn)生放電生成氣，主要是臭氧（ozone，O3）和負(fù)離子（negative air ion，NAI）（包括O2-、H2O-、O3-等），用一定濃度的放電生成氣對(duì)果品進(jìn)行短期處理或長(zhǎng)期貯藏使環(huán)境中保持一定濃度的放電生成氣，從而抑制果實(shí)呼吸，減少果品腐爛，延長(zhǎng)果蔬貯藏期的保鮮技術(shù)[4-5]?？諝夥烹姳ｕr技術(shù)具有能耗低、操作簡(jiǎn)便、安全環(huán)保等特點(diǎn)，針對(duì)空氣放電的大部分研究集中在以果品貯藏保鮮為代表的保鮮技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)空氣放電生成氣抑菌機(jī)理的研究相對(duì)而言較少，本實(shí)驗(yàn)研究空氣放電處理對(duì)蓮藕采后的腐敗菌尖孢鐮刀菌的抑菌作用。

空氣放電技術(shù)的抑菌作用主要體現(xiàn)在臭氧和負(fù)離子都有很高的氧化活性，其作用于細(xì)胞壁，能夠影響甚至破壞細(xì)胞壁（膜）結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性，造成細(xì)胞正常生理紊亂，從而抑制和殺滅病原菌[2,6]。利用本實(shí)驗(yàn)室已獲專利授權(quán)的空氣放電裝置[7]對(duì)蓮藕采后主要腐敗菌尖孢鐮刀菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示空氣放電處理能顯著抑制該菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有明顯的破環(huán)作用[8-9]。微生物細(xì)胞膜的保護(hù)及傳遞信息的功能與整個(gè)細(xì)胞生命活動(dòng)息息相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)將從物質(zhì)代謝和能量代謝角度研究空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌生理代謝的影響，并在此基礎(chǔ)上研究空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜完整性、流動(dòng)性等生理功能的影響，從細(xì)胞水平闡明空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌的影響，為空氣放電處理抑制蓮藕腐敗及其在果蔬保鮮中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為蓮藕貯藏期病原菌，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室分離、純化、鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）北京陸橋責(zé)任技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ATP檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI） 上海貝博生物科技有限公司；1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）、DiBAC4(3) 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QT2SVP500一體化臭氧發(fā)生器 深圳市松野電器有限公司；MIC-03臭氧變送器 深圳市藍(lán)月測(cè)控技術(shù)有限公司；TFB-YA278負(fù)離子發(fā)生器 天長(zhǎng)市創(chuàng)普電子有限公司；DM-3000熒光顯微鏡 德國(guó)Leica公司；guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀 美國(guó)Merck Millipore公司；Oxygraph液相氧電極 英國(guó)Hansatech公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

F. oxysporum在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，在菌落邊緣打出直徑6 mm的菌餅移至新的PDA平板中央，當(dāng)密閉空氣放電設(shè)備內(nèi)ozone和NAI生成氣達(dá)到設(shè)定濃度后將樣品放入：ozone組（濃度6.87 mg/m3）、NAI組（濃度5×106ions/cm3）、ozone+NAI組（6.87 mg/m3ozone+5×106ions/cm3NAI同時(shí)處理），每組均處理18 h，重復(fù)3 皿，以不做任何處理為對(duì)照（CK組）。各處理組分別取4 個(gè)菌餅移至100 mL PDB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)5 d（26 ℃、120 r/min），抽濾得菌絲真空冷凍干燥后保存。

1.3.2 能源物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

1.3.2.1 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

參照吳方麗[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。精確稱取不同處理的干菌絲0.25 g，加蒸餾水50 mL、濃硫酸7.5 mL，煮沸5 min。冷卻至室溫，用3 mol/L NaOH溶液中和至中性。定容至250 mL，過濾。取濾液10 mL置于三角瓶中，然后加入斐林試劑a、b液各5 mL，微沸2 min后加次甲基藍(lán)指示劑2 滴。在沸騰狀態(tài)下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%葡萄糖溶液滴定至藍(lán)色正好褪去，記錄葡萄糖溶液的消耗量，按式（1）計(jì)算總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：V0為空白實(shí)驗(yàn)消耗的葡萄糖溶液體積/mL；V為樣品消耗的葡萄糖溶液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.2.2 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

參照杜亞楠[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。精確稱取不同處理的干菌絲0.05 g，分別放入干燥的三角瓶中。然后在各瓶中分別加入5 mL 0.05 mol/L的NaOH溶液濕潤(rùn)，之后再加入20 mL雙縮脲試劑，漩渦振蕩5 min，室溫靜置反應(yīng)30 min，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液吸光度。蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式（2）計(jì)算。

式中：m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)量/mg；m2為樣品質(zhì)量/mg。

1.3.2.3 脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

參照張憲利等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。精確稱取不同處理的干菌絲0.45 g用定量濾紙包好，置于索氏脂肪抽提器中。連接已恒質(zhì)量的抽脂瓶，加入無水乙醚。55 ℃水浴加熱提取14 h左右。提取完畢后，水浴蒸去殘留乙醚，再于100～105 ℃烘箱中干燥8 h至恒質(zhì)量。脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式（3）計(jì)算。

式中：m3為提取后殘留樣品干質(zhì)量/mg；m4為樣品干質(zhì)量/mg。

1.3.3 菌絲能量代謝的分析

1.3.3.1 呼吸作用的測(cè)定

將培養(yǎng)7 d的PDA平板放入空氣放電設(shè)備中處理：ozone（濃度6.87 mg/m3）組、NAI（濃度5×106ions/cm3）組、ozone（6.87 mg/m3）+NAI同時(shí)處理（5×106ions/cm3）組每組各處理3 h后，輕輕刮下菌絲，準(zhǔn)確稱取0.05 g，放入含2 mL蒸餾水的反應(yīng)杯中。參考Clark型氧電極的極譜法測(cè)定菌絲體的呼吸作用[13]。呼吸影響率按式（4）計(jì)算，正值表示促進(jìn)，負(fù)值表示抑制。

式中：R為處理組耗氧速率/（nmol/（min·mg））；R0為對(duì)照組耗氧速率。

1.3.3.2 ATP含量的測(cè)定

F. oxysporum空氣放電處理同1.3.1節(jié)，不同處理組的平板在26 ℃生化培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)7 d后將菌絲輕輕刮下，加入2 mL裂解液冰上研磨勻漿裂解，然后4 ℃ 12 000×g離心5 min，取上清液備用。按照體積比1∶9的比例用稀釋液稀釋ATP檢測(cè)試劑得工作液，加100 μL ATP檢測(cè)工作液到檢測(cè)孔，室溫放置3～5 min，以使本底性的ATP全部被消耗掉。再向孔內(nèi)加上20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，3～5 s后置于熒光酶標(biāo)儀中檢測(cè)化學(xué)發(fā)光。

1.3.4 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜的損傷

PDA平板菌絲培養(yǎng)及處理同1.3.1節(jié)，取不同組的平板，將其產(chǎn)生的分生孢子用無菌水潤(rùn)洗下，離心收集孢子（4 ℃、1 000×g、5 min），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）懸浮。在接種菌餅后的PDA平板中插入滅菌蓋玻片同1.3.1節(jié)中空氣放電處理，培養(yǎng)7 d后，輕輕取出爬好菌絲的蓋玻片。

1.3.4.1 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

孢子染色：取洗滌后的孢子細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL PI染液，輕輕混勻，室溫避光染色10 min，制作玻片置于熒光顯微鏡觀察[14]。

菌絲染色：用PBS將PI染色液20 倍稀釋，取出爬好菌絲的蓋玻片，加適量染色液于玻片上，室溫避光染色10 min，用PBS洗滌玻片2 次，吸水紙小心擦干，置于熒光顯微鏡下觀察[15]。

1.3.4.2 細(xì)胞內(nèi)容物滲出的測(cè)定

F. oxysporum在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，在菌落邊緣打出直徑6 mm的菌餅取4 塊移至滅菌后的100 mL PDB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)3 d（26 ℃、120 r/min），經(jīng)3 層無菌紗布過濾沖洗收集菌絲，加入100 mL PBS（0.05 mol/L、pH 7.0）搖勻，移取10 mL至直徑9 cm培養(yǎng)皿，輕輕搖晃使其攤勻在培養(yǎng)皿中，處理組將皿移至空氣放電設(shè)備內(nèi)各不同處理的濃度同1.3.1節(jié)，分別處理6 h和12 h，每個(gè)處理重復(fù)3 皿，以不做任何處理為對(duì)照。

胞內(nèi)電解質(zhì)的滲出：收集菌液，測(cè)其電導(dǎo)率[16]。

胞內(nèi)大分子物質(zhì)的滲出：收集處理后的菌液，12 000×g離心2 min，取上清液在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度[17]。

1.3.4.3 細(xì)胞膜流動(dòng)性的測(cè)定

取6.97 mg DPH溶于四氫呋喃得3 mmol/L DPH染色母液4 ℃冷藏備用。稀釋得濃度為1×107個(gè)/mL的孢子懸液，用體積分?jǐn)?shù)0.37%甲醛溶液固定30 min，PBS洗滌后加入DPH染色液使其終濃度為0.3 mmol/L，室溫染色45 min，PBS洗滌后置于熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為361 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為443 nm[18]。

1.3.4.4 細(xì)胞膜電位的測(cè)定

取DiBAC4(3)染料25 mg溶于PBS配制成0.1 mg/mL的母液，4 ℃冷藏備用。PBS稀釋得50 μg/mL的DiBAC4(3)染色液，適量孢子細(xì)胞重懸于500 μL染色液中濃度為1×106個(gè)/mL，避光孵育1 h，PBS洗滌2 次，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，收集綠色熒光[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，使用DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用Tukey法和LSD法多重比較各處理組之間的差異性。采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，流式細(xì)胞儀圖像由Flowjo 7.6軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌能源物質(zhì)代謝的影響

圖 1 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌能源物質(zhì)代謝的影響Fig. 1 Effect of air discharge on energy metabolism of F. oxysporum

糖、脂和蛋白質(zhì)是微生物主要的能源物質(zhì)，對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要?？諝夥烹娞幚砗?，圖1A中菌絲總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于CK組（P＜0.05），并且ozone+NAI處理組顯著高于ozone和NAI單獨(dú)處理組（P＜0.05）；對(duì)于菌絲蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ozone+NAI處理組和ozone單獨(dú)處理組顯著高于CK組（P＜0.05），且ozone+NAI處理組作用效果最為明顯（圖1B）；由圖1C可以看出，空氣放電處理對(duì)菌絲脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著影響。

空氣放電處理后菌絲糖和蛋白質(zhì)產(chǎn)生積累，初步斷定是由于分解代謝受到抑制[10-11]。脂肪作為后備能源物質(zhì)，在糖類物質(zhì)供給不足的情況下才加以利用，處理組本身糖類含量充足，故脂肪含量未發(fā)生變化[10]。

2.2 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌呼吸作用的影響

由圖2可知，NAI、ozone和ozone+NAI 3 種不同處理顯著抑制菌絲的呼吸作用（P＜0.05），且呼吸抑制率分別為14.74%、54.65%、58.47%，ozone+NAI處理組和ozone單獨(dú)處理組作用效果顯著優(yōu)于NAI單獨(dú)處理組（P＜0.05），空氣放電處理顯著抑制了尖孢鐮刀菌菌絲體的呼吸作用，ozone的抑制效果強(qiáng)于NAI。

圖 2 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌呼吸作用的影響Fig. 2 Effect of air discharge on respiration of F. oxysporum

2.3 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌ATP含量的影響

圖 3 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌ATP相對(duì)含量的影響Fig. 3 Effect of air discharge on relative ATP content of F. oxysporum

3 種不同處理后菌絲內(nèi)ATP含量均顯著減少（P＜0.05），ozone和ozone+NAI對(duì)ATP合成的抑制效果顯著強(qiáng)于NAI處理組（P＜0.05）。線粒體是細(xì)胞有氧呼吸合成ATP的主要場(chǎng)所，呼吸耗氧量（圖2）及能量（圖3）減少，說明菌絲線粒體功能受到破壞。

空氣放電處理導(dǎo)致菌絲細(xì)胞糖和蛋白質(zhì)含量增多，呼吸強(qiáng)度減弱，結(jié)合處理后菌絲生長(zhǎng)受到抑制，判定空氣放電處理抑制了菌絲的分解代謝，而呼吸作用正是物質(zhì)氧化分解、釋放能量的過程，與處理后菌絲ATP含量顯著減少的結(jié)果相互印證。

2.4 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜完整性的影響

PI是一種DNA結(jié)合性染料，其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488 nm和630 nm，產(chǎn)生紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細(xì)胞膜，只能染死細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光越強(qiáng)，則說明細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重。

由圖4可見，暗場(chǎng)中觀察，CK組孢子細(xì)胞PI染色熒光強(qiáng)度微弱，處理組（NAI、ozone和ozone+NAI）中細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其中ozone+NAI處理組熒光最強(qiáng)，說明空氣放電處理破壞了細(xì)胞膜的完整性。已有研究運(yùn)用相同染色方法發(fā)現(xiàn)一些抗菌劑及重金屬離子對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜也存在不同程度的損傷[20-21]。

圖 4 尖孢鐮刀菌PI染色結(jié)果Fig. 4 PI staining of F. oxysporum

2.5 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)容物滲出的影響

圖 5 空氣放電處理對(duì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲出的影響Fig. 5 Effect of air discharge on electrolyte release

由圖5可見，3 個(gè)處理組中，ozone處理組和ozone+NAI處理組在不同處理時(shí)間菌液電導(dǎo)率均顯著高于CK組（P＜0.05），而NAI處理組無明顯變化。處理12 h時(shí)，ozone+NAI復(fù)合處理作用效果優(yōu)于ozone單獨(dú)處理（P＜0.05）。說明ozone和ozone+NAI處理對(duì)F. oxysporum的細(xì)胞膜有顯著的破壞作用，導(dǎo)致小分子電解質(zhì)滲出，致使細(xì)胞外液電導(dǎo)率顯著增加。

由圖6可見，ozone處理組和ozone+NAI處理組在不同處理時(shí)間菌液在260 nm波長(zhǎng)處的吸光度均顯著高于CK組（P＜0.05），說明核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)透過細(xì)胞膜從菌體滲出行為顯著增加，且ozone+NAI復(fù)合處理作用效果強(qiáng)于ozone單獨(dú)處理（P＜0.05），而NAI處理組吸光度無明顯變化。此結(jié)果與前述空氣放電處理對(duì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲出的影響趨勢(shì)一致。進(jìn)一步證明空氣放電處理可破壞尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜完整性，這與空氣處理破壞蓮藕采后腐敗菌鐮刀菌M4細(xì)胞膜，導(dǎo)致電解、核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)滲出的結(jié)論一致[16]。

圖 6 空氣放電處理對(duì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)滲出的影響Fig. 6 Effect of air discharge on release of intracellular macromolecules

2.6 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

細(xì)胞膜由磷脂雙分子層和貫穿、鑲嵌在其中及吸附在其表面的蛋白質(zhì)組成。膜的流動(dòng)性主要指膜脂肪酸鏈部分及膜蛋白的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。熒光探針DPH可以輕松地與細(xì)胞質(zhì)膜中磷脂的脂烴鏈區(qū)結(jié)合而不破壞細(xì)胞膜的完整性，結(jié)合后由于介質(zhì)黏度增加，順反異構(gòu)化受到抑制而成為唯一能發(fā)光的全反構(gòu)型[22]。DPH標(biāo)記成功后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

圖 7 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響Fig. 7 Effect of air discharge on cell membrane fluidity of F. oxysporum

DPH熒光強(qiáng)度降低表明結(jié)構(gòu)有序性低或細(xì)胞膜流動(dòng)性高[18,23]。由圖7可知，與CK組相比，3 個(gè)處理組DPH熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），表明空氣放電處理導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性顯著降低，與弱磁場(chǎng)促使樟芝菌絲體細(xì)胞膜流動(dòng)性增加的作用不同[22]。細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸組分的過氧化是引起膜流動(dòng)性下降的主要因素[24]，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，通透性增強(qiáng)，可能導(dǎo)致膜孔的產(chǎn)生，影響膜正常的流動(dòng)性[25]，結(jié)合空氣放電處理后，F(xiàn). oxysporum細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比值顯著降低[8]，通透性增強(qiáng)（圖5），表明膜結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致膜功能的喪失。

2.7 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜電位的影響

DiBAC4(3)是一種細(xì)胞膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，進(jìn)入細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光，細(xì)胞膜電位降低時(shí)熒光染料DiBAC4(3)內(nèi)流增加，從而可以檢測(cè)到熒光強(qiáng)度的增加，反之亦然[26-27]。

圖 8 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜電位的影響Fig. 8 Effect of air discharge on membrane potential of F. oxysporum

如圖8A所示，與CK組相比，處理組細(xì)胞DiBAC4(3)熒光強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.05），表明空氣放電處理促使細(xì)胞內(nèi)的電位降低，誘導(dǎo)細(xì)胞超極化。這可能與細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)被破壞，通透性增強(qiáng)，金屬離子外流有關(guān)[28]。

染色細(xì)胞分布圖8B中，相對(duì)于CK組，處理組染色細(xì)胞分布曲線均發(fā)生一定程度的左移，細(xì)胞整體熒光強(qiáng)度減弱，與圖8A中結(jié)果一致。

3 討 論

空氣放電主要是發(fā)揮臭氧和負(fù)離子的抑菌作用。臭氧的抑菌活性源于對(duì)細(xì)胞重要組分的氧化作用。臭氧已被證明攻擊細(xì)菌的許多成分，包括蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸和呼吸酶，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的肽聚糖、酶和核酸，以及孢衣和病毒衣殼上蛋白質(zhì)和肽聚糖[29]。對(duì)于真菌殺滅的機(jī)理可能為臭氧破壞了真菌的細(xì)胞壁，進(jìn)而破壞了細(xì)胞膜，使得細(xì)胞內(nèi)容物滲出，細(xì)胞裂解，最終導(dǎo)致真菌的徹底死亡[30]?？諝夥烹娺^程中產(chǎn)生的負(fù)離子在空氣中形成的電荷密度可能會(huì)改變細(xì)胞表面電荷，影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的完整性[8]。

細(xì)胞膜是細(xì)胞抵御外界刺激的首道屏障，發(fā)揮著維持細(xì)胞完整性、物質(zhì)運(yùn)輸、受體和信息傳遞等重要作用，其完整性（通透性）和流動(dòng)性的改變，與維持細(xì)胞的正常代謝和生理功能密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑制作用的基礎(chǔ)上研究發(fā)現(xiàn)空氣放電處理后尖孢鐮刀菌正常代謝活動(dòng)紊亂，包括菌絲物質(zhì)代謝平衡被破壞、呼吸強(qiáng)度減弱、耗氧量降低、ATP合成減少等；同時(shí)尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜完整性受到破壞，通透性增大、流動(dòng)性降低、膜電位增加，證明細(xì)胞膜是空氣放電發(fā)揮抑菌作用的靶點(diǎn)之一。結(jié)果還表明臭氧與負(fù)離子之間具有協(xié)同作用，與單獨(dú)處理相比，ozone+NAI處理組更能有效破壞尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。