劉夢蝶，李彩云，李 潔,2,3,，嚴守雷,2,3，王清章,2,3

（1.華中農業(yè)大學食品科技學院，湖北 武漢 430070；2.環(huán)境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術研究中心，湖北 武漢 430070）

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）是我國最具特色、栽培面積最大的水生經(jīng)濟作物，目前，蓮藕已成為我國重要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一。蓮藕水分質量分數(shù)高達78%，營養(yǎng)成分豐富，貯運過程中易于褐變和腐敗，成為制約其出口的主要因素[1-2]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為蓮藕采后的主要腐敗菌[3]。

空氣放電保鮮法是通過采用非均電場無聲放電或電暈放電使空氣電離產(chǎn)生放電生成氣，主要是臭氧（ozone，O3）和負離子（negative air ion，NAI）（包括O2-、H2O-、O3-等），用一定濃度的放電生成氣對果品進行短期處理或長期貯藏使環(huán)境中保持一定濃度的放電生成氣，從而抑制果實呼吸，減少果品腐爛，延長果蔬貯藏期的保鮮技術[4-5]。空氣放電保鮮技術具有能耗低、操作簡便、安全環(huán)保等特點，針對空氣放電的大部分研究集中在以果品貯藏保鮮為代表的保鮮技術的應用，對空氣放電生成氣抑菌機理的研究相對而言較少，本實驗研究空氣放電處理對蓮藕采后的腐敗菌尖孢鐮刀菌的抑菌作用。

空氣放電技術的抑菌作用主要體現(xiàn)在臭氧和負離子都有很高的氧化活性，其作用于細胞壁，能夠影響甚至破壞細胞壁（膜）結構和功能，影響細胞內酶的活性，造成細胞正常生理紊亂，從而抑制和殺滅病原菌[2,6]。利用本實驗室已獲專利授權的空氣放電裝置[7]對蓮藕采后主要腐敗菌尖孢鐮刀菌進行抑菌實驗，結果顯示空氣放電處理能顯著抑制該菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，對其細胞結構具有明顯的破環(huán)作用[8-9]。微生物細胞膜的保護及傳遞信息的功能與整個細胞生命活動息息相關，本實驗將從物質代謝和能量代謝角度研究空氣放電處理對尖孢鐮刀菌生理代謝的影響，并在此基礎上研究空氣放電處理對尖孢鐮刀菌細胞膜完整性、流動性等生理功能的影響，從細胞水平闡明空氣放電處理對尖孢鐮刀菌的影響，為空氣放電處理抑制蓮藕腐敗及其在果蔬保鮮中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為蓮藕貯藏期病原菌，經(jīng)本實驗室分離、純化、鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）北京陸橋責任技術有限公司；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB） 國藥集團化學試劑有限公司；ATP檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI） 上海貝博生物科技有限公司；1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）、DiBAC4(3) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

QT2SVP500一體化臭氧發(fā)生器 深圳市松野電器有限公司；MIC-03臭氧變送器 深圳市藍月測控技術有限公司；TFB-YA278負離子發(fā)生器 天長市創(chuàng)普電子有限公司；DM-3000熒光顯微鏡 德國Leica公司；guava easyCyte 8流式細胞儀 美國Merck Millipore公司；Oxygraph液相氧電極 英國Hansatech公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及處理

F. oxysporum在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，在菌落邊緣打出直徑6 mm的菌餅移至新的PDA平板中央，當密閉空氣放電設備內ozone和NAI生成氣達到設定濃度后將樣品放入：ozone組（濃度6.87 mg/m3）、NAI組（濃度5×106ions/cm3）、ozone+NAI組（6.87 mg/m3ozone+5×106ions/cm3NAI同時處理），每組均處理18 h，重復3 皿，以不做任何處理為對照（CK組）。各處理組分別取4 個菌餅移至100 mL PDB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)5 d（26 ℃、120 r/min），抽濾得菌絲真空冷凍干燥后保存。

1.3.2 能源物質質量分數(shù)的測定

1.3.2.1 總糖質量分數(shù)的測定

參照吳方麗[10]的方法進行測定。精確稱取不同處理的干菌絲0.25 g，加蒸餾水50 mL、濃硫酸7.5 mL，煮沸5 min。冷卻至室溫，用3 mol/L NaOH溶液中和至中性。定容至250 mL，過濾。取濾液10 mL置于三角瓶中，然后加入斐林試劑a、b液各5 mL，微沸2 min后加次甲基藍指示劑2 滴。在沸騰狀態(tài)下用質量分數(shù)0.1%葡萄糖溶液滴定至藍色正好褪去，記錄葡萄糖溶液的消耗量，按式（1）計算總糖質量分數(shù)。

式中：V0為空白實驗消耗的葡萄糖溶液體積/mL；V為樣品消耗的葡萄糖溶液體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.2.2 蛋白質量分數(shù)的測定

參照杜亞楠[11]的方法進行測定。精確稱取不同處理的干菌絲0.05 g，分別放入干燥的三角瓶中。然后在各瓶中分別加入5 mL 0.05 mol/L的NaOH溶液濕潤，之后再加入20 mL雙縮脲試劑，漩渦振蕩5 min，室溫靜置反應30 min，在540 nm波長處測定上清液吸光度。蛋白質量分數(shù)按式（2）計算。

式中：m1為從標準曲線上查得的蛋白質量/mg；m2為樣品質量/mg。

1.3.2.3 脂肪質量分數(shù)的測定

參照張憲利等[12]的方法進行測定。精確稱取不同處理的干菌絲0.45 g用定量濾紙包好，置于索氏脂肪抽提器中。連接已恒質量的抽脂瓶，加入無水乙醚。55 ℃水浴加熱提取14 h左右。提取完畢后，水浴蒸去殘留乙醚，再于100～105 ℃烘箱中干燥8 h至恒質量。脂肪質量分數(shù)按式（3）計算。

式中：m3為提取后殘留樣品干質量/mg；m4為樣品干質量/mg。

1.3.3 菌絲能量代謝的分析

1.3.3.1 呼吸作用的測定

將培養(yǎng)7 d的PDA平板放入空氣放電設備中處理：ozone（濃度6.87 mg/m3）組、NAI（濃度5×106ions/cm3）組、ozone（6.87 mg/m3）+NAI同時處理（5×106ions/cm3）組每組各處理3 h后，輕輕刮下菌絲，準確稱取0.05 g，放入含2 mL蒸餾水的反應杯中。參考Clark型氧電極的極譜法測定菌絲體的呼吸作用[13]。呼吸影響率按式（4）計算，正值表示促進，負值表示抑制。

式中：R為處理組耗氧速率/（nmol/（min·mg））；R0為對照組耗氧速率。

1.3.3.2 ATP含量的測定

F. oxysporum空氣放電處理同1.3.1節(jié)，不同處理組的平板在26 ℃生化培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)7 d后將菌絲輕輕刮下，加入2 mL裂解液冰上研磨勻漿裂解，然后4 ℃ 12 000×g離心5 min，取上清液備用。按照體積比1∶9的比例用稀釋液稀釋ATP檢測試劑得工作液，加100 μL ATP檢測工作液到檢測孔，室溫放置3～5 min，以使本底性的ATP全部被消耗掉。再向孔內加上20 μL樣品或標準品，3～5 s后置于熒光酶標儀中檢測化學發(fā)光。

1.3.4 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌細胞膜的損傷

PDA平板菌絲培養(yǎng)及處理同1.3.1節(jié)，取不同組的平板，將其產(chǎn)生的分生孢子用無菌水潤洗下，離心收集孢子（4 ℃、1 000×g、5 min），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）懸浮。在接種菌餅后的PDA平板中插入滅菌蓋玻片同1.3.1節(jié)中空氣放電處理，培養(yǎng)7 d后，輕輕取出爬好菌絲的蓋玻片。

1.3.4.1 細胞膜完整性的測定

孢子染色：取洗滌后的孢子細胞，調整細胞濃度約為107個/mL，取100 μL細胞懸液，加入5 μL PI染液，輕輕混勻，室溫避光染色10 min，制作玻片置于熒光顯微鏡觀察[14]。

菌絲染色：用PBS將PI染色液20 倍稀釋，取出爬好菌絲的蓋玻片，加適量染色液于玻片上，室溫避光染色10 min，用PBS洗滌玻片2 次，吸水紙小心擦干，置于熒光顯微鏡下觀察[15]。

1.3.4.2 細胞內容物滲出的測定

F. oxysporum在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，在菌落邊緣打出直徑6 mm的菌餅取4 塊移至滅菌后的100 mL PDB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)3 d（26 ℃、120 r/min），經(jīng)3 層無菌紗布過濾沖洗收集菌絲，加入100 mL PBS（0.05 mol/L、pH 7.0）搖勻，移取10 mL至直徑9 cm培養(yǎng)皿，輕輕搖晃使其攤勻在培養(yǎng)皿中，處理組將皿移至空氣放電設備內各不同處理的濃度同1.3.1節(jié)，分別處理6 h和12 h，每個處理重復3 皿，以不做任何處理為對照。

胞內電解質的滲出：收集菌液，測其電導率[16]。

胞內大分子物質的滲出：收集處理后的菌液，12 000×g離心2 min，取上清液在260 nm波長處測其吸光度[17]。

1.3.4.3 細胞膜流動性的測定

取6.97 mg DPH溶于四氫呋喃得3 mmol/L DPH染色母液4 ℃冷藏備用。稀釋得濃度為1×107個/mL的孢子懸液，用體積分數(shù)0.37%甲醛溶液固定30 min，PBS洗滌后加入DPH染色液使其終濃度為0.3 mmol/L，室溫染色45 min，PBS洗滌后置于熒光分光光度計檢測。激發(fā)波長為361 nm，發(fā)射波長為443 nm[18]。

1.3.4.4 細胞膜電位的測定

取DiBAC4(3)染料25 mg溶于PBS配制成0.1 mg/mL的母液，4 ℃冷藏備用。PBS稀釋得50 μg/mL的DiBAC4(3)染色液，適量孢子細胞重懸于500 μL染色液中濃度為1×106個/mL，避光孵育1 h，PBS洗滌2 次，置于流式細胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm，收集綠色熒光[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗重復3 次，使用DPS 7.05統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。采用Tukey法和LSD法多重比較各處理組之間的差異性。采用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，流式細胞儀圖像由Flowjo 7.6軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 空氣放電對尖孢鐮刀菌能源物質代謝的影響

圖 1 空氣放電對尖孢鐮刀菌能源物質代謝的影響Fig. 1 Effect of air discharge on energy metabolism of F. oxysporum

糖、脂和蛋白質是微生物主要的能源物質，對生物體的生長發(fā)育至關重要。空氣放電處理后，圖1A中菌絲總糖質量分數(shù)顯著高于CK組（P＜0.05），并且ozone+NAI處理組顯著高于ozone和NAI單獨處理組（P＜0.05）；對于菌絲蛋白質量分數(shù)，ozone+NAI處理組和ozone單獨處理組顯著高于CK組（P＜0.05），且ozone+NAI處理組作用效果最為明顯（圖1B）；由圖1C可以看出，空氣放電處理對菌絲脂肪質量分數(shù)無顯著影響。

空氣放電處理后菌絲糖和蛋白質產(chǎn)生積累，初步斷定是由于分解代謝受到抑制[10-11]。脂肪作為后備能源物質，在糖類物質供給不足的情況下才加以利用，處理組本身糖類含量充足，故脂肪含量未發(fā)生變化[10]。

2.2 空氣放電對尖孢鐮刀菌呼吸作用的影響

由圖2可知，NAI、ozone和ozone+NAI 3 種不同處理顯著抑制菌絲的呼吸作用（P＜0.05），且呼吸抑制率分別為14.74%、54.65%、58.47%，ozone+NAI處理組和ozone單獨處理組作用效果顯著優(yōu)于NAI單獨處理組（P＜0.05），空氣放電處理顯著抑制了尖孢鐮刀菌菌絲體的呼吸作用，ozone的抑制效果強于NAI。

圖 2 空氣放電對尖孢鐮刀菌呼吸作用的影響Fig. 2 Effect of air discharge on respiration of F. oxysporum

2.3 空氣放電對尖孢鐮刀菌ATP含量的影響

圖 3 空氣放電對尖孢鐮刀菌ATP相對含量的影響Fig. 3 Effect of air discharge on relative ATP content of F. oxysporum

3 種不同處理后菌絲內ATP含量均顯著減少（P＜0.05），ozone和ozone+NAI對ATP合成的抑制效果顯著強于NAI處理組（P＜0.05）。線粒體是細胞有氧呼吸合成ATP的主要場所，呼吸耗氧量（圖2）及能量（圖3）減少，說明菌絲線粒體功能受到破壞。

空氣放電處理導致菌絲細胞糖和蛋白質含量增多，呼吸強度減弱，結合處理后菌絲生長受到抑制，判定空氣放電處理抑制了菌絲的分解代謝，而呼吸作用正是物質氧化分解、釋放能量的過程，與處理后菌絲ATP含量顯著減少的結果相互印證。

2.4 空氣放電對尖孢鐮刀菌細胞膜完整性的影響

PI是一種DNA結合性染料，其激發(fā)和發(fā)射波長分別為488 nm和630 nm，產(chǎn)生紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細胞膜，只能染死細胞。在熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光越強，則說明細胞膜損傷越嚴重。

由圖4可見，暗場中觀察，CK組孢子細胞PI染色熒光強度微弱，處理組（NAI、ozone和ozone+NAI）中細胞熒光強度明顯增強，其中ozone+NAI處理組熒光最強，說明空氣放電處理破壞了細胞膜的完整性。已有研究運用相同染色方法發(fā)現(xiàn)一些抗菌劑及重金屬離子對細菌的細胞膜也存在不同程度的損傷[20-21]。

圖 4 尖孢鐮刀菌PI染色結果Fig. 4 PI staining of F. oxysporum

2.5 空氣放電處理對尖孢鐮刀菌細胞內容物滲出的影響

圖 5 空氣放電處理對胞內電解質滲出的影響Fig. 5 Effect of air discharge on electrolyte release

由圖5可見，3 個處理組中，ozone處理組和ozone+NAI處理組在不同處理時間菌液電導率均顯著高于CK組（P＜0.05），而NAI處理組無明顯變化。處理12 h時，ozone+NAI復合處理作用效果優(yōu)于ozone單獨處理（P＜0.05）。說明ozone和ozone+NAI處理對F. oxysporum的細胞膜有顯著的破壞作用，導致小分子電解質滲出，致使細胞外液電導率顯著增加。

由圖6可見，ozone處理組和ozone+NAI處理組在不同處理時間菌液在260 nm波長處的吸光度均顯著高于CK組（P＜0.05），說明核酸和蛋白質等大分子物質透過細胞膜從菌體滲出行為顯著增加，且ozone+NAI復合處理作用效果強于ozone單獨處理（P＜0.05），而NAI處理組吸光度無明顯變化。此結果與前述空氣放電處理對胞內電解質滲出的影響趨勢一致。進一步證明空氣放電處理可破壞尖孢鐮刀菌細胞膜完整性，這與空氣處理破壞蓮藕采后腐敗菌鐮刀菌M4細胞膜，導致電解、核酸和蛋白質等大分子物質滲出的結論一致[16]。

圖 6 空氣放電處理對胞內大分子物質滲出的影響Fig. 6 Effect of air discharge on release of intracellular macromolecules

2.6 空氣放電對尖孢鐮刀菌細胞膜流動性的影響

細胞膜由磷脂雙分子層和貫穿、鑲嵌在其中及吸附在其表面的蛋白質組成。膜的流動性主要指膜脂肪酸鏈部分及膜蛋白的運動狀態(tài)。熒光探針DPH可以輕松地與細胞質膜中磷脂的脂烴鏈區(qū)結合而不破壞細胞膜的完整性，結合后由于介質黏度增加，順反異構化受到抑制而成為唯一能發(fā)光的全反構型[22]。DPH標記成功后，熒光強度增強。

圖 7 空氣放電對尖孢鐮刀菌細胞膜流動性的影響Fig. 7 Effect of air discharge on cell membrane fluidity of F. oxysporum

DPH熒光強度降低表明結構有序性低或細胞膜流動性高[18,23]。由圖7可知，與CK組相比，3 個處理組DPH熒光強度均顯著增強（P＜0.05），表明空氣放電處理導致細胞膜流動性顯著降低，與弱磁場促使樟芝菌絲體細胞膜流動性增加的作用不同[22]。細胞膜上不飽和脂肪酸組分的過氧化是引起膜流動性下降的主要因素[24]，細胞膜結構受損，通透性增強，可能導致膜孔的產(chǎn)生，影響膜正常的流動性[25]，結合空氣放電處理后，F(xiàn). oxysporum細胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比值顯著降低[8]，通透性增強（圖5），表明膜結構的破壞導致膜功能的喪失。

2.7 空氣放電對尖孢鐮刀菌細胞膜電位的影響

DiBAC4(3)是一種細胞膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，進入細胞與胞漿內的蛋白質結合后才發(fā)出熒光，細胞膜電位降低時熒光染料DiBAC4(3)內流增加，從而可以檢測到熒光強度的增加，反之亦然[26-27]。

圖 8 空氣放電對尖孢鐮刀菌細胞膜電位的影響Fig. 8 Effect of air discharge on membrane potential of F. oxysporum

如圖8A所示，與CK組相比，處理組細胞DiBAC4(3)熒光強度顯著減弱（P＜0.05），表明空氣放電處理促使細胞內的電位降低，誘導細胞超極化。這可能與細胞膜磷脂雙分子層結構被破壞，通透性增強，金屬離子外流有關[28]。

染色細胞分布圖8B中，相對于CK組，處理組染色細胞分布曲線均發(fā)生一定程度的左移，細胞整體熒光強度減弱，與圖8A中結果一致。

3 討 論

空氣放電主要是發(fā)揮臭氧和負離子的抑菌作用。臭氧的抑菌活性源于對細胞重要組分的氧化作用。臭氧已被證明攻擊細菌的許多成分，包括蛋白質、細胞膜上的不飽和脂肪酸和呼吸酶，細胞質內的肽聚糖、酶和核酸，以及孢衣和病毒衣殼上蛋白質和肽聚糖[29]。對于真菌殺滅的機理可能為臭氧破壞了真菌的細胞壁，進而破壞了細胞膜，使得細胞內容物滲出，細胞裂解，最終導致真菌的徹底死亡[30]?？諝夥烹娺^程中產(chǎn)生的負離子在空氣中形成的電荷密度可能會改變細胞表面電荷，影響細胞壁結構和功能，進而破壞細胞膜的完整性[8]。

細胞膜是細胞抵御外界刺激的首道屏障，發(fā)揮著維持細胞完整性、物質運輸、受體和信息傳遞等重要作用，其完整性（通透性）和流動性的改變，與維持細胞的正常代謝和生理功能密切相關。本實驗在空氣放電處理對尖孢鐮刀菌具有抑制作用的基礎上研究發(fā)現(xiàn)空氣放電處理后尖孢鐮刀菌正常代謝活動紊亂，包括菌絲物質代謝平衡被破壞、呼吸強度減弱、耗氧量降低、ATP合成減少等；同時尖孢鐮刀菌細胞膜完整性受到破壞，通透性增大、流動性降低、膜電位增加，證明細胞膜是空氣放電發(fā)揮抑菌作用的靶點之一。結果還表明臭氧與負離子之間具有協(xié)同作用，與單獨處理相比，ozone+NAI處理組更能有效破壞尖孢鐮刀菌細胞膜結構。