薛宏坤，譚佳琪，劉 釵，劉成海,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

近年來合成色素過量使用引發(fā)一系列安全問題備受人們的廣泛關(guān)注，利用天然色素取代合成色素成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)?；ㄉ帐且活愄烊凰苄缘闹参锷兀瑏碓磸V泛，具有誘人的色澤和特殊的芳香。研究表明花色苷具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抗腫瘤[3]、預(yù)防心血管疾病[4]等生理活性。因此，有必要對(duì)花色苷進(jìn)一步深入研究，對(duì)提高花色苷的學(xué)術(shù)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值有重要的指導(dǎo)意義。‘巨峰’葡萄是我國主要的栽培品種之一，因其粒大肉多、酸甜適中等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。‘巨峰’葡萄主要被加工成果汁和果酒，在其加工生產(chǎn)過程中形成的副產(chǎn)物‘巨峰’葡萄皮，其內(nèi)部含有大量花色苷（以錦葵素為主）、多酚等活性成分。而‘巨峰’葡萄皮通常被遺棄，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)?！薹濉咸哑樘烊簧氐闹饕希珜?duì)這種優(yōu)質(zhì)的天然色素資源研究開發(fā)較少，而且錦葵素相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)品稀缺且價(jià)格昂貴。因此，建立簡單易行的分離純化花色苷的方法獲得單一高純度的花色苷組分是必要的。

目前，花色苷的分離純化方法主要有柱層析法、膜分離法、高效逆流色譜法、高效制備型液相色譜法等。Wang Erlei等[5]和陳陽[6]等均采用大孔樹脂分別對(duì)藍(lán)莓花色苷和紅花蕓豆色素進(jìn)行分離純化，經(jīng)樹脂純化后樣品的純度得到顯著提高。鄧潔紅等[7]利用紙層析-薄層層析聯(lián)用技術(shù)從刺葡萄皮中分離純化得到5 種花色苷組分，但是分離純化過程復(fù)雜，所需純化周期長。滕學(xué)峰[8]運(yùn)用單一的Sephadex LH-20葡聚糖凝膠技術(shù)對(duì)黑大豆皮中色素進(jìn)行分離純化，分離效果較好，但是由于提取物中雜質(zhì)含量較多，容易造成層析柱的堵塞和污染。在花色苷結(jié)構(gòu)鑒定方面，常用的鑒定方法主要有紫外-可見光譜法、紅外光譜法、液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用法和核磁共振法等。Rasines-Perea等[9]利用紅外光譜法鑒定出紅葡萄中含有12 種花色苷組分。Escribano-Bailon等[10]采用紫外-可見光譜法-HPLC-MS法鑒定奇異果中花色苷結(jié)構(gòu)，研究表明，奇異果中含有8 種花色苷。曹少謙[11]利用NHA-9大孔樹脂-Toyopearl TSK HW-40S凝膠層析聯(lián)用技術(shù)對(duì)血橙花色苷進(jìn)行分離純化，并對(duì)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，研究發(fā)現(xiàn)純化技術(shù)可行，經(jīng)純化后得到8 種花色苷組分。花色苷的抗腫瘤活性方面，劉奕琳[12]、陳建楊[13]和薛宏坤[14]等分別研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)靛果花色苷洗脫物、馬鈴薯花色苷提取物和藍(lán)莓提取物對(duì)HepG2肺癌和A549肝癌細(xì)胞增殖的影響，研究發(fā)現(xiàn)3 種花色苷提取物均能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長，而針對(duì)花色苷單一組分的抗腫瘤活性研究有限。目前，利用大孔樹脂-Sephadex LH-20葡聚糖凝膠聯(lián)用技術(shù)分離純化‘巨峰’葡萄皮中花色苷，并探究純化后的單一高純度花色苷組分的抗腫瘤活性鮮見報(bào)道。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)采用AB-8大孔樹脂-Sephadex LH-20葡聚糖凝膠聯(lián)用技術(shù)分離純化‘巨峰’葡萄皮中花色苷，獲得單一高純度的花色苷組分；利用超高效液相色譜三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)純化后所得的花色苷組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及探究花色苷組分的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘巨峰’葡萄（采摘于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院），成熟后于8月中旬采摘，洗凈，晾干，手工去皮，果皮置于冷凍干燥機(jī)凍至48 h，然后用植物粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過40 目篩，制成葡萄皮粉末，避光密封保存在-18 ℃冰箱中。

AB-8大孔樹脂 天津市大鈞科技有限公司；聚酰胺樹脂 日本三菱公司；Sephadex LH-20 美國Sigma公司；乙醇、乙酸、乙酸乙酯、冰醋酸、氯化鉀、甲酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）和DMEM完全培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）上海萊昂生物科技有限公司；HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)；超純水（過0.45 μm濾膜） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀和1290超高效液相色譜-G6500四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；DK-98-IIA型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；TG18K-II型高速離心機(jī) 上海趙迪生物科技有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵 鞏義儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-mini1240紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；HZQ-F全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；TS100倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；ZE5流式細(xì)胞儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程如圖1所示。

圖 1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖Fig. 1 Flow chart of the experimental design

1.3.2 ‘巨峰’葡萄皮花色苷的純化與分離

1.3.2.1 ‘巨峰’葡萄皮色素粗提液的制備

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確稱取50 g葡萄皮粉末，以1∶8的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為60%酸化乙醇溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.05%醋酸），恒溫水浴35 ℃，避光浸提6 h，真空抽濾，收集濾液，將其在35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇，將濃縮液以4 000 r/min離心15 min，取上清液以1∶4的體積比加入無水丙酮，避光35 ℃水浴振蕩1 h，真空抽濾，將其在35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收丙酮，取色素濃縮液以1∶1的體積比加入無水乙醚萃取2 次，棄上層有機(jī)相，將得到的萃取液以1∶1的體積比再加入無水乙酸乙酯萃取2 次，將水層除去有機(jī)溶劑，然后再將其在35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，最終得到‘巨峰’葡萄皮色素粗提液。采用pH示差法[15]測得花色苷的質(zhì)量濃度為1.280 6 mg/mL。

1.3.2.2 AB-8大孔樹脂對(duì)‘巨峰’葡萄皮花色苷的吸附純化

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取10 mL經(jīng)預(yù)處理后的AB-8大孔樹脂濕法裝柱（2.6 cm×60 cm），控制上樣流速為5 s/滴，當(dāng)從AB-8大孔樹脂流出液的吸光度值達(dá)到上樣液的1/10時(shí)，認(rèn)為大孔樹脂吸附飽和，此時(shí)停止進(jìn)樣，然后用蒸餾水洗脫樹脂至洗出液無色，最后依次用酸化的去離子水（含體積分?jǐn)?shù)0.02% HCl溶液）、體積分?jǐn)?shù)60%酸化乙醇溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.05% HCl溶液）和體積分?jǐn)?shù)80%酸化乙醇溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.05% HCl溶液）洗脫層析柱，洗脫流速為4 s/滴，洗脫液在35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮（樣品1）。

1.3.2.3 聚酰胺樹脂對(duì)‘巨峰’葡萄皮花色苷的吸附純化

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取10 mL經(jīng)預(yù)處理后的聚酰胺樹脂濕法裝柱（3.0 cm×40 cm），樣品1過聚酰胺柱，上樣流速為5 s/滴，當(dāng)從聚酰胺柱流出液的吸光度達(dá)到上樣液的1/10時(shí)，認(rèn)為聚酰胺樹脂吸附飽和，此時(shí)停止進(jìn)樣，然后用蒸餾水洗脫樹脂至洗出液無色，將體積分?jǐn)?shù)為50%的酸化甲醇溶液（含體積分?jǐn)?shù)為0.1% HCl溶液）作為洗脫液對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫流速為4 s/滴，洗脫液在35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮（樣品2）。

1.3.2.4 Sephadex LH-20凝膠對(duì)‘巨峰’葡萄皮花色苷的分離純化

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)預(yù)處理后的Sephadex LH-20凝膠濕法裝柱（1.0 cm×100 cm），樣品1經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾后上樣，上樣體積為2 mL，當(dāng)樣品1完全滲入膠床后，然后用體積分?jǐn)?shù)為50%的酸化甲醇溶液（含體積分?jǐn)?shù)為0.1% HCl溶液）對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫流速為10 s/滴，當(dāng)色素帶在色譜柱中分離開后，將洗脫流速調(diào)至為2 s/滴，每2 mL一管，根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，合并純度大于95%的收集管，在真空冷凍干燥機(jī)中將其凍干，得色素I、色素II、色素III、色素IV粉末，花色苷組分得率的計(jì)算如式（1）所示。

式中：m為花色苷組分粉末質(zhì)量/g；m0為‘巨峰’葡萄皮粉末質(zhì)量/g。

1.3.3 紫外-可見光譜分析

利用體積分?jǐn)?shù)為0.01%鹽酸甲醇溶液溶解樣品1、樣品2、色素I、色素II、色素III和色素IV粉末，將其在200～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[16]，分析其光譜特征。

1.3.4 高效液相色譜分析

樣品處理：將樣品1、樣品2、色素I、色素III和色素IV分別用體積分?jǐn)?shù)0.1% HCl-甲醇溶液稀釋后，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液，溶液過0.45 μm濾膜，用于HPLC分析。

色譜條件：1100 C18柱（150 mm×4.6 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相A為V（甲酸）∶V（水）=1∶5；流動(dòng)相B為V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=57.5∶40∶2.5；洗脫程序：10% B（0 min）～30% B（5 min）～30% B（10 min）～100% B（15 min）～100% B（25 min）～10% B（28 min）；流速為0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；檢測波長為520 nm。

1.3.5 超高效液相色譜三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析

HPLC條件：1290 C18柱（150 mm×2.1 mm，5 μm），流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸乙腈；洗脫程序：15% B（0 min）～40% B（9 min）～60% B（15 min）～75% B（25 min）～90% B（25 min）～15% B（30 min）；流速為0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；掃描波長為190～400 nm。色素檢測波長為287 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源，質(zhì)譜采用正離子掃描方式，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 200，毛細(xì)管電壓4.5 kV，霧化器壓力138 kPa，干燥氣溫度335 ℃。

1.3.6 抗腫瘤活性指標(biāo)

1.3.6.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

采用MTT法測定‘巨峰’葡萄皮花色苷組分對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，參照文獻(xiàn)[17]方法測定，細(xì)胞存活率計(jì)算如式（2）所示。

式中：As為樣品組的吸光度；Ac為空白對(duì)照組的吸光度。

1.3.6.2 花色苷組分對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)考察花色苷組分對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞侵襲能力。參考楊三維等[18]研究紫小麥花色苷對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力影響的操作方法。在倒置顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，侵襲率的計(jì)算如式（3）所示。

1.3.6.3 花色苷組分對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)期HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)板（2.5×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h，用色素I、色素III和色素IV處理24 h，移除培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用PBS洗兩次，然后采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色法，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Statistix 8.0軟件對(duì)每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析；采用SAS 8.0軟件分析結(jié)果的差異顯著性；Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘巨峰’葡萄皮花色苷得率

依據(jù)式（1）計(jì)算可得，色素I、色素III和色素IV的得率分別為（0.108±0.011）%、（0.053±0.007）%和（0.038±0.005）%，而根據(jù)‘巨峰’葡萄皮花色苷的含量計(jì)算可得花色苷的理論得率范圍為0.21%～0.25%。因此，該純化分離方法在制備效率上是可行的。

2.2 紫外-可見光譜分析結(jié)果

經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后的樣品（樣品1）和經(jīng)聚酰胺樹脂純化后的樣品（樣品2）的紫外-可見吸收光譜如圖2所示。樣品1和樣品2在280 nm左右和520 nm左右均有最大吸收峰，由此可判斷花色苷是經(jīng)AB-8大孔樹脂和聚酰胺樹脂純化后的色素溶液中主要成分[19]。并且樣品1和樣品2在330 nm左右也有弱的吸收峰，說明樣品1和樣品2溶液中可能存在?；幕ㄉ誟20]。

圖 2 樣品的紫外-可見掃描光譜Fig. 2 UV-Vis absorption spectra of purified samples

樣品1再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠分離純化后，‘巨峰’葡萄皮色素溶液被凝膠柱分離成4 個(gè)不同顏色的色素帶，分別為色素I（淡粉色）、色素II（橙色）、色素III（紫紅色）和色素IV（粉紅色），對(duì)各色素帶在200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光譜掃描，其結(jié)果如圖3所示。色素II在280 nm和520 nm附近均無紫外吸收峰，結(jié)果表明色素II為非花色苷類的物質(zhì)，不再進(jìn)行后續(xù)的研究。而色素I、色素III和色素IV均在280 nm和520 nm附近有最大吸收峰，由此可知，色素I、色素III和色素IV均為花色苷類物質(zhì)，另外色素III在305 nm波長處有弱的吸收峰，由此說明色素III可能為?；幕ㄉ疹愇镔|(zhì)[21]。

圖 3 經(jīng)Sephadex LH-20分離純化的4 條色素帶的紫外-可見光譜Fig. 3 UV-Vis absorption spectra of four pigments isolated by Sephadex LH-20 chromatography

2.3 HPLC分析結(jié)果

利用HPLC在520 nm波長處將經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后的樣品（樣品1）和經(jīng)聚酰胺樹脂純化后的樣品（樣品2）進(jìn)行分析，其色譜結(jié)果如圖4所示。

圖 4 純化后樣品在520 nm波長處的HPLC色譜圖Fig. 4 High performance liquid chromatography at 520 nm of purified samples

由圖4a可知，在520 nm條件下，樣品1共檢測出6 種花色苷組分，出峰時(shí)間集中在13～22 min范圍內(nèi)。出峰時(shí)間在13.69 min和21.84 min為樣品1中主要的2 種花色苷組分，兩種組分相對(duì)含量分別為38.15%和47.62%。其他4 種組分的出峰時(shí)間依次為15.51、16.99、19.05、20.04 min，其相對(duì)含量分別為2.57%、4.08%、4.05%、3.53%。由圖4b可知，樣品2共檢測出4 種花色苷組分，出峰時(shí)間在13.63 min和21.86 min仍為主要的2 種花色苷組分，其相對(duì)含量分別為27.58%和69.11%，其他兩峰的出峰時(shí)間分別為17.06 min和19.09 min，相對(duì)含量分別為2.08%和1.23%。對(duì)比樣品1和樣品2中花色苷組分比例發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)不同純化方法所得的花色苷比例差別較大。其原因是在聚酰胺純化花色苷過程中，一部分花色苷被吸附在聚酰胺樹脂上，從而使得純化后的花色苷組分比例相差較大[22]。聚酰胺對(duì)出峰時(shí)間在13.69 min的花色苷吸附較為嚴(yán)重，原因需要進(jìn)一步分析。以花色苷比例和分離度為考察因素，將樣品1再經(jīng)過Sephadex LH-20繼續(xù)純化分離。

樣品1經(jīng)Sephadex LH-20分離純化得到色素I、色素III和色素IV，三者的HPLC圖見圖5，色素I、色素III和色素IV的出峰時(shí)間分別為13.73、17.07和21.82 min，分別與樣品1中出峰時(shí)間為13.69、16.99、21.84 min的花色苷組分相對(duì)應(yīng)，依據(jù)歸一法計(jì)算組分的相對(duì)含量，在520 nm條件下，3 種花色苷組分的純度分別為98.52%、96.84%和91.36%，采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步鑒定以上3 種花色苷組分的結(jié)構(gòu)，另外也說明了Sephadex LH-20具有較好的分離效果。

圖 5 經(jīng)Sephadex LH-20分離純化后的3 種花色苷組分在520 nm波長處的HPLC圖Fig. 5 High performance liquid chromatography at 520 nm of three anthocyanin components isolated by Sephadex LH-20 chromatography

2.4 超高效液相色譜三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果

為了研究色素I、色素III和色素IV的花色苷組成，采用超高效液相色譜三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)3 種色素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定?；ㄉ盏慕Y(jié)構(gòu)根據(jù)分子離子峰、碎片及標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間來確定。3 種花色苷的MS圖見圖6，其鑒定結(jié)果如表1所示。

由圖6a1、a2可知，色素I保留時(shí)間為2.57 min，MS和MS2信息表明，其分子離子峰[M+]為595.4，在質(zhì)譜中檢測到兩個(gè)碎片離子分別為m/z 449.1和m/z 287.2。m/z 287是矢車菊色素的特征離子，碎片（[M-146]+）對(duì)應(yīng)于花色苷分子中失去一個(gè)鼠李糖基所得的碎片，而m/z 287的碎片（[M-146-162]+）對(duì)應(yīng)于m/z 449的碎片上再失去一個(gè)己糖基得到的碎片。該研究結(jié)果與Liu Liang等[23]研究荔枝皮花色苷和Eguchi等[24]研究蕎麥花色苷中矢車菊-3-蕓香糖苷的質(zhì)譜信息相一致。因此，色素I被鑒定為矢車菊-3-蕓香糖苷。由圖6b1、b2可知，色素III保留時(shí)間為4.87 min，MS和MS2信息表明，其分子離子峰[M+]為801，碎片離子m/z分別為331.1、493.2和639.1。m/z 331是錦葵色素的特征離子，m/z 493對(duì)應(yīng)錦葵色素的單己糖，m/z 639對(duì)應(yīng)錦葵素-香豆酰單己糖，碎片（[M-146]+）對(duì)應(yīng)于香豆酸脫去一分子水后所得的碎片。A440nm/Aλmax的百分比為13.2%，推測色素III為3,5-雙己糖，該研究結(jié)果與王維茜等[22]研究刺葡萄皮花色苷和Hong等[25]研究果汁花色苷中的錦葵素-3,5-雙葡萄糖苷-香豆酰的MS信息相一致。因此，色素III被鑒定為錦葵素-3,5-雙葡萄糖苷-香豆酰。這于紫外-可見光譜分析中的色素III可能為?；幕ㄉ者@一結(jié)論相吻合。由圖6c1、c2可知，色素IV保留時(shí)間為6.35 min，MS和MS2信息表明，其分子離子峰[M+]為493，碎片離子m/z 331.1。m/z 331是錦葵色素的特征離子，丟失碎片162，可能為葡萄糖和半乳糖，結(jié)合文獻(xiàn)[26-27]可知色素IV為錦葵-3-半乳糖苷。

圖 6 3 種花色苷組分一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 6 Mass and tandem mass spectra of three anthocyanin components

表 1 ‘巨峰’葡萄皮花色苷種類鑒定Table 1 Identification of three anthocyanins isolated from kyoho grape skins

2.5 花色苷組分對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞生長增殖抑制作用

色素I、色素III和色素IV對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞的增殖抑制效果如圖7所示。

圖 7 花色苷組分對(duì)癌細(xì)胞生長抑制作用的劑量效應(yīng)Fig. 7 Inhibitory effect of anthocyanins on the growth of cancer cells

由圖7可知，3 種花色苷組分處理HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞24 h后，兩種癌細(xì)胞的存活率隨3 種花色苷組分質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)顯著降低的趨勢（P＜0.05）。當(dāng)花色苷組分質(zhì)量質(zhì)量濃度在50 μg/mL時(shí)，色素I、色素III和色素IV樣品對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞的存活率分別為（90.01±2.03）%、（85.11±1.86）%、（91.02±1.55）%和（90.03±1.43）%、（83.99±1.89）%、（91.98±1.52）%，而當(dāng)花色苷組分質(zhì)量濃度在600 μg/mL時(shí)，色素I、色素III和色素IV樣品對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞的存活率分別為（51.98±0.87）%、（46.05±0.92）%、（58.05±0.84）%和（47.97±0.89）%、（42.04±0.82）%、（53.12±0.91）%，前者較后者HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞的存活率分別降低了38.03%、39.06%、32.97%和42.06%、41.95%、38.86%。結(jié)果表明，色素I、色素III和色素IV均能顯著抑制HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞的增殖，且質(zhì)量濃度越大，抑制效果越顯著，表現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)3 種花色苷組分的質(zhì)量濃度均選擇600 μg/mL。對(duì)比相對(duì)質(zhì)量濃度花色苷組分對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌存活率發(fā)現(xiàn)，色素III對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌的增殖抑制效果最強(qiáng)，其次是色素I，最低的是色素IV。分析原因是由于色素III中花色苷組分?；；笫沟没ㄉ粘尸F(xiàn)“三明治”結(jié)構(gòu)，提高花色苷穩(wěn)定性和生理活性[28]。崔清慧[29]研究同樣發(fā)現(xiàn)，?；幕ㄉ諏?duì)抗腫瘤的效果優(yōu)于未?；幕ㄉ铡Ｉ豂中花色苷的酚羥基數(shù)較色素IV多，酚羥基數(shù)越多，生理活性越強(qiáng)[30]。因此，色素V對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌增殖的抑制效果優(yōu)于色素IV。

2.6 花色苷組分對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

侵襲能力通常被作為評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的重要指標(biāo)之一。因此，研究3 種花色苷組分（質(zhì)量濃度為600 μg/mL）對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞侵襲影響，結(jié)果如圖8和表2所示。

圖 8 3 種花色苷組分對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響（200×）Fig. 8 Effect of three anthocyanin components on the invasion of cancer cells (200 ×)

表 2 3 種花色苷組分對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Table 2 Effects of three anthocyanins on the invasive ability of HepG2 hepatoma cells and A549 lung cancer cells

由圖8和表2可知，分別與HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞對(duì)照組相比，3 種花色苷組分處理HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯降低，侵襲率顯著降低。依據(jù)式（3）可計(jì)算出對(duì)照組、色素I、色素III和色素IV對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞侵襲率分別為100%、（55.81±1.69）%、（19.65±1.24）%、（34.16±0.97）%和100%、（48.18±1.62）%、（14.57±0.79）%、（34.12±1.02）%，分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，3 種花色苷組分均能顯著抑制HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞侵襲能力，3 種花色苷組分對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞侵襲抑制能力大小順序依次是色素III＞色素I＞色素IV。該研究結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.7 花色苷組分對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞凋亡的影響

3 種花色苷組分（質(zhì)量濃度為600 μg/mL）處理HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞24 h后，癌細(xì)胞凋亡情況如圖9所示。

圖 9 3 種花色苷組分對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響Fig. 9 Effects of three anthocyanin components on the apoptosis of cancer cells

目前，大量研究證明花色苷提取物具有抗氧化和清除自由基的能力[31]，對(duì)癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，加速癌細(xì)胞的凋亡[32]。因此，本實(shí)驗(yàn)在MTT和細(xì)胞侵襲的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究3 種花色苷組分對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響。由圖9可知，色素I、色素III和色素IV對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡率分別為（17.90±0.22）%、（30.45±1.39）%和（15.99±0.36）%，與對(duì)照組相比，凋亡率分別提高了15.76%、28.31%和13.85%。結(jié)果表明，3 種花色苷組分均能顯著提高HepG2肝癌細(xì)胞凋亡率，且促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的效果順序依次為色素III＞色素I＞色素IV。Urias-Lugo[33]和Yeh[34]等同樣發(fā)現(xiàn)花色苷能顯著提高癌細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制是通過上調(diào)和下調(diào)相關(guān)的凋亡蛋白和凋亡因子，從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。由圖9d可知，色素I、色素III和色素IV對(duì)A549肺癌細(xì)胞凋亡率分別為（20.86±0.88）%、（33.66±1.52）%和（17.03±1.04）%，與對(duì)照組A549肺癌細(xì)胞凋亡率分別提高了20.44%、33.24%和16.61%。結(jié)果表明，3 種花色苷組分均能顯著提高A549肺癌細(xì)胞的凋亡率，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的效果順序同HepG2肝癌細(xì)胞。這與Chen Peini等[35]研究桑葚花色苷和陳建楊[13]研究特色馬鈴薯花色苷對(duì)A549肺癌細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果相似。癌細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果與MTT和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明花色苷組分具有顯著的抗腫瘤活性。

3 結(jié) 論

‘巨峰’葡萄皮色素粗提物經(jīng)AB-8大孔樹脂純化-葡聚糖凝膠Sephadex LH-20純化后，得到4 種組分，其中色素II為非花色苷類，色素I、色素III和色素IV分別為矢車菊-3-蕓香糖苷、錦葵素-3,5-雙葡萄糖苷-香豆酰和錦葵-3-半乳糖苷，其得率和純度分別為（0.108±0.011）%、（0.053±0.007）%、（0.038±0.005）%和98.52%、96.84%、91.36%；而‘巨峰’葡萄皮色素粗提物經(jīng)AB-8大孔樹脂純化-聚酰胺樹脂純化后，樣品在相同HPLC條件下檢測，花色苷組成比例相差較大，原因需進(jìn)一步研究。探究色素I、色素III和色素IV對(duì)抗腫瘤活性的影響發(fā)現(xiàn)，3 種花色苷組分均能顯著抑制HepG2肝癌細(xì)胞和A549肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并且顯著增加癌細(xì)胞的凋亡。3 種花色苷組分的抗腫瘤效果順序依次為色素III＞色素I＞色素IV。研究結(jié)果為花色苷分離鑒定及天然抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。